侯鹏，董玉晶，李爽，许凤

（齐齐哈尔医学院药学院，黑龙江 齐齐哈尔 161000）

反应型香豆素N2H4荧光探针的生物成像研究

侯鹏，董玉晶，李爽，许凤

（齐齐哈尔医学院药学院，黑龙江 齐齐哈尔 161000）

为合成适用于生物监测的水合肼荧光探针，该文基于水合肼诱导乙酰基脱保护生成7-羟基-4-甲基香豆素的原理，设计合成一种具有高灵敏度、高选择性的水合肼荧光增强型有机分子探针。采用光谱学测试及细胞荧光成像的方法，对探针的性能进行表征。实验结果表明：在缓冲溶液中，加入N2H4后，探针溶液的荧光光谱在451nm处产生一个显著的荧光增强峰（33倍），定量分析检测限为9×10-8mol/L（y=20.316 7+25.177 8x，r=0.9996），与其他测试物相比，探针表现出对N2H4较高的选择性和专一性（F水合肼=787，F其他=22～24）；此外，细胞内的荧光成像实验，证明该荧光探针具有潜在检测细胞内N2H4的能力。

水合肼；合成；香豆素；荧光探针

0 引言

水合肼（N2H4·H2O）作为一种重要的精细化工原料，广泛应用于工农业生产、医药行业和航空领域中[1]。然而，水合肼本身具有一定的毒性，研究表明，空气中泄漏高浓度的水合肼可能会诱发人体的病变，若皮肤长时间接触水合肼，可引起积累性中毒；肼的液体和蒸气对眼有刺激作用，严重者会引起暂时性失明、血液异常，并对人体的肝脏、肺、肾和中枢神经系统造成不可治愈的伤害[2]。美国环境保护局定义环境中的水合肼浓度上限值为1×10-8[3]。2014年，上海理工大学崔磊等[4]设计合成了一种基于比色、光学比率以及化学发光的新型水合肼探针。2015年，Ugo小组利用TiO2纳米线作为光电化学传感器对水合肼进行检测，同年，沈伟国教授课题组利用普鲁士蓝@纳米银/石墨的协同作用修饰电极检测水合肼。现有的水合肼测试方法包括色谱法、电化学方法、荧光法和滴定法[5-6]；其中，荧光光谱法具有操作简便、灵敏度高、选择性好以及可以实时检测的优点，成为对物质定量研究的重要分析手段[7-8]。目前，国内外文献已报道的用于检测环境及生物体中水合肼含量的荧光探针主要基于乙酰丙酰基的脱保护[9]、Gabriel反应[10]、4-溴丁酰基脱保护[11]等机制；但是，针对水合肼检测的荧光探针报道则为数不多，并且在实施过程还受到各种因素的限制，如较低的pH条件、合成过程复杂、反应时间长、灵敏度低、以及不能应用于生物成像等缺点。

香豆素类衍生物具有较高的光学特性、良好的稳定性、较大的Stokes位移以及较好的水溶性，目前，针对不同离子的香豆素类荧光探针不断被开发出来[12-13]。本文利用香豆素作为荧光信号表达基团，基于水合肼选择性地脱去乙酰基保护，开发出新型的N2H4荧光探针并将其应用于细胞生物成像中（见图1）。

图1 N2H4荧光探针分子1的合成路线及N2H4识别机理

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

BRUKER AV600光谱仪（600MHz）（美国Bruker）；Bruker ultraflex II基质辅助时间飞行质谱（美国Bruker）；LS45-荧光分光光度计（美国Perkin）；UV2450型紫外-可见分光光度计（日本岛津）。

乙酰乙酸乙酯，阿拉丁试剂公司；间苯二酚，上海国药试剂有限公司；4-溴丁酸，天津市福晨化学试剂厂；乙酸酐，天津市东丽区天大化学试剂厂；香豆素，质量分数99%，武汉远成共创科技有限公司；水合肼，质量分数80%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；试验所用阴离子氯化盐和阳离子钠盐均购置于上海国药试剂有限公司。

1.2 荧光探针分子1的合成

将7-羟基-4-甲基香豆素176mg溶解在10mL二氯甲烷溶液中，加入0.3mL三乙胺，室温搅拌15min后，向混合液中加入乙酸酐3mL，继续室温搅拌6h，终止反应，将反应液倒入含有40mL水的烧杯中，二氯甲烷萃取，饱和氯化钠洗涤，有机层无水硫酸钠干燥。旋转蒸干溶剂，柱层析分离（石油醚∶乙酸乙酯= 8∶1，ν∶ν），得到白色固体即为产物（收率：87%）。1H NMR（600MHz，DMSO）δ7.82（d，J=8.6 Hz，1H），7.27（d，J= 2.1Hz，1H），7.19（dd，J=8.6，2.2Hz，1H），6.40（s，1H），2.44（s，3H），2.32（s，3H）。HRMS（EI）m/z calcd for [C12H10O4+H]+：219.0579，Found：219.0592。

1.3 光谱性质测试

将适量探针分子1经乙腈溶解配制成1×10-3mol/L储备液，4℃冷藏保存，将待分析物（K+，Na+，Mn2+，Mg2+，Ca2+，Zn2+，Al3+，Fe2+，Fe3+，Hg2+，F-，Cl-，Br-，I-，N3-，SO42-，CO32-，AcO-，P2O74-，ClO4-，Cys，GSH，Hcy，NH2OH，NH3，NH2（CH2）2NH2，TEA，尿素，硫脲）用去离子水溶解，配制成1×10-2mol/L被测物溶液。将0.03mL探针1储备液加入到0.87mL乙腈中，再加入0.03mL被测物质溶液，最后用缓冲液定容至3mL，混合均匀后，进行光谱测定。荧光分光光度计设定参数为λex=365nm，λem=451nm，狭缝宽度为10nm和10nm，电压为700V，灵敏度为2。

2 结果与讨论

2.1 光谱性质

探针1的光学信号行为如图2所示，由于探针分子结构中的酚羟基被乙酰基保护，导致分子荧光淬灭，所以将探针分子溶解在HEPES（pH 7.4）缓冲溶液中时，单独的探针分子（10μmol/L）不会呈现出荧光发射峰；但是，当加入N2H4（1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，80，100，150，200μmol/L）后，水合肼将进攻探针分子中的保护基团，使保护基团乙酰基脱去，释放出供电子基团羟基，此时溶液在451nm处出现一个明显的荧光发射峰，并且这个发射峰强度的变化与N2H4浓度变化成正相关，当N2H4的浓度达到200μmol/L时，在451nm处溶液的荧光强度是探针溶液本底荧光强度的33倍。并且探针分子对低浓度的N2H4也能产生明显的响应，向探针溶液中加入1μmol/L N2H4，溶液在451nm处仍然可以显示出相对于探针本底2倍的荧光增强。同时，在紫外灯照射下，将N2H4加入到探针溶液中，探针溶液的荧光由无色变为蓝色。

图2 探针分子1（10μmol/L）与不同物质量浓度（0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，80，100，150，200μmol/L）N2H4反应的荧光响应

2.2 定量检测

研究表明，水合肼的毒性与浓度成正比，低剂量的肼会抑制中枢神经系统，而高剂量的肼则会引起惊厥，大鼠在225×10-6浓度下，4.5 d便会致死[3]。文中选取不同物质量浓度的水合肼（0～200μmol/L）加入到探针1（10μmol/L）溶液中进行定量分析实验。以荧光强度为纵坐标，N2H4物质量浓度为横坐标，荧光强度-浓度曲线如图3所示，拟合后得到的方程为y=20.3167+25.177 8x，相关系数r=0.999 6。根据IUPAC[14]规定，计算得到探针分子对水合肼的检测限为9×10-8mol/L，上述结果表明，由于N2H4可以选择性地脱去乙酰基的保护，释放出荧光团，荧光恢复，因此探针对N2H4表现出高度灵敏的定量识别能力。与目前已报到的检测肼的方法相比[5-6]，本文中合成的探针分子具有非常低的检测限（9×10-8mol/L），适用于美国环保局定义的环保标准。

图3 探针1（10μmol/L）与N2H4（0～200μmol/L）反应的荧光强度-物质量浓度曲线

2.3 选择性和干扰实验

本文选取一些典型的离子（K+，Na+，Mn2+，Mg2+，Ca2+，Zn2+，Fe2+，Fe3+，Hg2+，Al3+，F-，Cl-，Br-，I-，AcO-，P2O74-，ClO4-，N3-，SO42-，CO32-）、常见的生物分子（Cys，GSH，Hcy）以及相关物质（NH2OH，NH3，NH2（CH2）2NH2，TEA，尿素，硫脲）作为分析物对探针与N2H4之间选择性识别能力进行评价。研究表明，只有探针1与N2H4作用后光谱中表现出显著的荧光增强。相同条件下，向探针溶液中加入其他测试物时，探针1的荧光行为只产生轻微变化（F水合肼=787，F其他=22～24，F表示荧光强度），这种响应与水合肼比起来极其微小。为了进一步验证探针的实际应用能力，将上述干扰物质加入到探针与N2H4的反应体系中，结果显示，探针1对N2H4的检测几乎没有受到干扰物质的影响（如图4、图5所示）。以上研究结果表明，探针1对N2H4具有一定的选择性。

2.4 pH的影响

当人体长期接触水合肼，积累的水合肼就会引起中毒，导致组织或器官病变，因此实现生理条件下对N2H4的检测具有十分重要的意义。文中测试了在不同pH值下探针1以及探针1与N2H4反应溶液的荧光强度。如图6所示，在pH 2.0～8.0范围内，探针1溶液的荧光强度基本恒定（F=17.13～21.28），表明探针在此pH范围内具有较好的稳定性。当pH值继续增大，此时探针1溶液的荧光强度不断增大，这种变化是由于碱性条件下，探针1中的乙酰基断裂，荧光强度恢复。同样的pH环境，向探针溶液中加入N2H4，结果显示，在pH 2.0～7.0之间反应溶液的荧光强度随pH值的增大而增强，在pH 7.0～10.0之间，反应溶液的荧光强度相对比较恒定，表明探针1与N2H4的反应可以在此范围内的生理条件下完成。因此，本文选择pH 7.4作为研究体系的pH值。

2.5 稳定性

在实际样品的检测中，探针分子以及反应产物分子的光学稳定性会对测定结果产生较大的影响。探针分子以及探针与N2H4作用后产物随时间的变化情况由图7可见，当探针溶液中加入N2H4，随时间延长荧光强度不断增强，说明探针分子结构中的保护基不断被N2H4进攻，释放出荧光团，荧光恢复，二者完全反应大约需要40min，并且完全转化为产物后，产物的荧光非常稳定，荧光强度不会随时间发生改变。同时，文中探讨了单独的探针分子溶液的稳定性，结果显示，探针1分子在测试体系中的荧光强度不会随时间变化，具有很好的光学稳定性。

图4 探针1（10μmol/L）与200μmol/L干扰离子反应的荧光响应（黑色柱）以及对探针1（10μmol/L）与N2H4（200μmol/L）反应的荧光行为的影响（条状柱）

图5 探针1（10μmol/L）与200μmol/L生物分子及相关物的荧光响应（黑色柱）以及对探针1（10μmol/L）与N2H4（200μmol/L）反应的荧光行为的影响（条状柱）

图6 不同pH条件下，探针分子1（10μmol/L）及探针分子与N2H4（200μmol/L）反应的荧光响应

图7 探针分子1（10μmol/L）及探针分子1（10μmol/L）加入N2H4（200μmol/L）后荧光强度随时间的变化情况

2.6 细胞成像研究

本文选择了存活率较高的人乳腺癌231细胞作为载体进行实验。如图8所示，在盛有人乳腺癌231细胞的6孔板中加入N2H4（50μmol/L）溶液，生理温度培养30min，缓冲液冲洗3次，再加入探针（5μmol/L）溶液，生理温度培养30min，经缓冲液冲洗3次，此时放置于荧光显微镜下观察，细胞内呈现出强烈的蓝色荧光，作为对比，实验中将人乳腺癌231细胞中只加入探针（5μmol/L）溶液，生理温度培养30min，缓冲液冲洗3次后，放置在显微镜下观察，此时的细胞没有呈现出任何的荧光。对比结果，细胞成像实验与该化合物的光学行为是一致的，因此，探针可以实现细胞内的N2H4检测。

3 结束语

本文以香豆素为母体，基于水合肼诱导乙酰基脱保护原理，合成了一种高灵敏的检测水合肼的荧光探针。相对于其他待测物，该方法可以在生理条件下完成水合肼进攻乙酰基，使其脱去保护，荧光团荧光恢复，光谱呈现明显的增强（33倍）。同时，细胞荧光成像实验证明了该探针具有检测生物体系内水合肼的能力。

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图8 细胞成像

（编辑：莫婕）

Biological imaging study of reactive coumarin N2H4fluorescent probe

HOU Peng，DONG Yujing，LI Shuang，XU Feng
（College of Pharmacy，Qiqihar Medical University，Qiqihar 161000，China）

This paper introduces an enhanced type of hydrazine hydrate organic molecular fluorescence probe of high sensitivity and selectivity for biological monitoring.Its mechanism of action is based on the N2H4-triggered cleavage of the acetyl moiety to give 7-hydroxy-4-methylcoumarin.The properties of probe were characterized by means of spectroscopical test and fluorescent cell imaging.Results show that after adding N2H4to the buffer solution，a significant fluorescence enhancement peak（33 times）appears at 451 nm of the fluorescence spectrum of probe solution.The quantitative analysis of detection limit is 9×10-8mol/L（y=20.316 7+25.177 8x，r=0.999 6）.The probe demonstrates high selectivity and specificity for N2H4compared with other test samples（FN2H4=787，Fothers=22-24）.In addition，the intracellular fluorescence imaging experiment shows that the fluorescence probe has the potential for N2H4detection in vivo.

hydrazine；synthesis；coumarin；fluorescence probe

A

1674-5124（2017）05-0053-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.05.012

2016-10-09；

2016-11-20

齐齐哈尔市科学技术计划项目（SFGG-201546）

侯鹏（1982-），女，黑龙江齐齐哈尔市人，讲师，博士，研究方向为有机小分子荧光探针的合成与应用。