范钊，陈遇英

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.杜尔伯特蒙古族自治县畜牧局）

中药不同提取方法对两种病原菌的抑制研究

范钊1，陈遇英2

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.杜尔伯特蒙古族自治县畜牧局）

为检测金黄色葡萄球菌及沙门氏菌的耐药性。通过制备黄连、黄芩、金银花、牡丹皮及柴胡不同提取方式及浓度的制剂，采用纸片扩散法对分离的两株细菌进行抑菌效果测定。结果显示：黄连的水提及酯提液在多数浓度下对金葡菌有中度抑菌效果；黄芩的酯提液、牡丹皮的水提液及金银花1.00 g·mL-1、0.75 g·mL-1时的水提液对金葡菌有中度抑制作用。对沙门氏菌，黄芩的水提液在1.00 g·mL-1时对其抑制效果最好，为中度抑菌；其他几种中药则效果偏低甚至无效果。提示此株沙门氏菌的耐药性很强，表明几种中药对金葡菌的效果相对较好。

金黄色葡萄球菌；沙门氏菌；中药

金黄色葡萄球菌及沙门氏菌是严重危害人类及动物生命健康的2种重要病原菌。金葡菌的致病性很强。可直接导致动物的创伤感染、乳腺炎及败血症[1]。沙门氏菌则具有极其广泛的动物宿主，可导致严重的败血症，也是重要的人畜共患病菌[2]。目前针对这2种病原菌所致疾病还是以抗生素治疗为主。而此类药物的大量应用必然使细菌的耐药水平不断升高，甚至出现多重耐药菌株[3]。此外动物源性食品中的药物残留也给人类及动植物的健康造成了很大隐患。在这种背景下，中草药的作用靶点多、不易产生耐药性、药物残留少及成本相对较低等优点逐渐显现，用以代替抗生素则拥有广阔的应用前景[4]。

2015年9月，笔者所在学校家畜传染病防治研究室新分离出1株金葡菌菌株及1株沙门氏菌菌株。通过对患病动物的剖检，初步判定致病力很强。研究采用5种常用中草药，通过不同方式制备不同浓度的提取液，以检验这5种中药对上述2个菌株的抑菌效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中药、菌株及主要试剂

柴胡（Bupleurum chinense DC.）、黄连（Coptis chinensis Franch.）、黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi.）、金银花（Lonicera japonica Thunb.）及牡丹皮（Paeonia suffruticosa Andr.）购自大庆惠民大药房；金黄色葡萄球菌（菌株编号为20150927XF）及沙门氏菌（菌株编号为20150906XF）由黑龙江八一农垦大学动物科技学院家畜传染病诊断与防治研究室提供；营养肉汤培养基（编号为BN-PYJ373）、营养琼脂培养基（编号为BN-PYJ478）及MH琼脂培养基（编号为BN-PYJ454）购自北京中科质检生物技术有限公司。

1.1.2 实验药液的制备

（1）水提取液

采取煎煮方法，将金银花、柴胡、黄连、黄芩、牡丹皮切碎，研磨成粉。各称取10 g加入50 mL纯化水，煮沸30 min，用抽滤器抽滤。药渣再加入50 mL纯化水煮沸30 min，抽滤。合并两次所得药液，加热蒸发至10 mL，即每毫升药液含1 g中药（浓度为1.00 g·mL-1）。后分别稀释为浓度0.75、0.50 g·mL-1及0.25 g·mL-1的中药制剂。高压蒸汽灭菌20 min，置于4℃冰箱中保存备用。

（2）酯提取液

采取乙酸乙酯浸泡法，称取金银花、柴胡、黄连、黄芩、牡丹皮10 g，加入50 mL乙酸乙酯浸泡24 h，抽滤。药渣再加入50 mL乙酸乙酯浸泡24 h，抽滤。合并2次所得药液，在水浴锅65℃条件下蒸去其中的乙酸乙酯。后加入乙醇10 mL，使每毫升药液含1 g中药（浓度为1.00g·mL-1的酯提取液原液）。然后分别稀释成浓度为0.75、0.50 g·mL-1及0.25 g·mL-1的中药制剂。高压蒸汽灭菌20 min，置于4℃冰箱中保存备用。

（3）菌悬液的制备

在生物安全柜中，用接种环蘸取金黄色葡萄球菌及沙门氏菌，分别接种于营养肉汤中。标记后置于37℃恒温培养箱中培养18 h。将营养琼脂培养基加热溶解、灭菌。在超净工作台中平铺于100 mm无菌平皿中，厚度约为4.5 mm，静置凝固。然后用接种环蘸取活化好的细菌划线接种于营养琼脂培养基上，置37℃恒温培养基箱中培养24 h。再用接种环蘸取单个菌落置于营养肉汤中扩增培养12 h。将金黄色葡萄球菌编为1号菌，沙门氏菌为2号菌。

1.1.3 药敏片的制备

选用新华中性滤纸，用打孔器打成直径为6 mm的圆形纸片。高压蒸汽灭菌后分别放入配制好的不同中药制剂中，浸泡40 min，取出放入37℃烘箱中烘干。在无菌条件下取1片烘干后的药敏片，放入灭菌的营养肉汤中检验其是否有污染。确认无污染后，放入4℃冰箱中保存备用。

1.2 方法

采用纸片扩散法。将溶解并高压灭菌的MH琼脂平铺于直径为100 mm的平皿中，制备厚度约为4.5 mm的MH琼脂培养基并静置凝固。用灭菌拭子分别蘸取1号及2号菌液，在平板表面涂布3～4次。每次旋转60度，使细菌可以均匀布满整个平板。后置室温下干燥5 min。

在生物安全柜中，用灭菌镊子将1.4中药敏片紧贴于平板表面。每个平皿贴4张纸片，其中3张为含不同浓度药液的纸片，另1张为阳性对照组。金黄色葡萄球菌组贴的是1.0×10-5g·片-1的琥乙红霉素药敏片，沙门氏菌组贴的1.0×10-5g·片-1的环丙沙星药敏片。将有药敏纸片的平皿置于37℃恒温箱培养24 h，后观察各纸片的抑菌效果并用游标卡尺测量抑菌圈直径。

以CLSIM100-24为标准进行判定。当抑菌圈直径小于10 mm时，说明相应药物有轻度的抑菌作用；当抑菌圈直径在10～15 mm时，说明相应药物具有中度抑菌作用；当抑菌圈直径大于15 mm时，说明相应药物为高度抑菌。

2 结果与分析

2.1 黄连的抑菌效果

通过观察测量，黄连的抑菌情况见表1。

由表1可知，黄连提取液对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均有抑制作用。黄连水提液浓度在0.75 g·mL-1时对金葡菌的作用最强，为高度抑菌；酯提液的浓度在0.75 g·mL-1时对金葡菌的作用较好，为中度抑菌。黄连水提液的浓度在1.00 g·mL-1时对沙门氏菌的抑菌效果好于其他浓度，为轻度抑菌；酯提液浓度在0.75 g·mL-1时的抑菌效果好于其他浓度，为轻度抑菌。整体观察，黄连提取液对金葡菌的抑制作用好于沙门氏菌。琥乙红霉素对金葡菌的抑制效果好于2种提取液，环丙沙星对沙门氏菌的抑制效果略好于2种提取液。

表1 黄连的不同提取液对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌效果Table 1The antimicrobial effect of different extracts of Rhizoma coptidis on Staphylococcus aureus and Salmonella

2.2 黄芩的抑菌效果

通过观察测量，黄芩的抑菌情况见表2。

表2 黄芩的不同提取液对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌效果Table 2The antimicrobial effect of different extracts of Radix scutellariae on Staphylococcus aureus and Salmonella

由表2可知，黄芩提取液对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均有抑制作用。黄芩水提液浓度在0.75 g·mL-1时对金葡菌的作用略好于其他浓度，为轻度抑菌；酯提液的浓度在0.75 g·mL-1时对金葡菌的作用较好，为中度抑菌。黄芩水提液的浓度在1.00 g·mL-1时对沙门氏菌的抑菌效果好于其他浓度，为中度抑菌；酯提液浓度在1.00 g·mL-1时的抑菌效果略好于其他浓度，为轻度抑菌。整体观察，黄芩提取液对金葡菌的抑制作用与沙门氏菌相差不大。琥乙红霉素对金葡菌的抑制效果明显好于2种提取液，环丙沙星对沙

门氏菌的抑制效果与2种提取液持平。

2.3 金银花的抑菌效果

通过观察测量，金银花的抑菌情况见表3。

表3 金银花的不同提取液对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌效果Table 3The antimicrobial effect of different extracts of Flos lonicerae on Staphylococcus aureus and Salmonella

由表3可知，金银花提取液对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均有抑制作用。金银花水提液浓度在0.75 g·mL-1时对金葡菌的作用好于其他浓度，为中度抑菌；酯提液的浓度在1.00 g·mL-1时对金葡菌的作用略好于其他浓度，为轻度抑菌。金银花水提液的浓度在1.00 g·mL-1时对沙门氏菌的抑菌效果略好于其他浓度，为轻度抑菌；酯提液浓度在1.00 g·mL-1时的抑菌效果好于其他浓度，为轻度抑菌。整体观察，金银花提取液对金葡菌的抑制作用好于沙门氏菌。琥乙红霉素对金葡菌的抑制效果明显好于2种提取液，环丙沙星对沙门氏菌的抑制效果略好于2种提取液。

2.4 牡丹皮的抑菌效果

通过观察测量，牡丹皮的抑菌情况见表4。

表4 牡丹皮的不同提取液对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌效果Table 4The antimicrobial effect of different extracts of Cortex moutan on Staphylococcus aureus and Salmonella

由表4可知，牡丹皮提取液对金黄色葡萄球菌有抑制作用，对沙门氏菌的作用较弱。牡丹皮水提液浓度在0.75 g·mL-1时对金葡菌的作用好于其他浓度，为中度抑菌；酯提液的浓度在0.50 g·mL-1时对金葡菌的作用略好于其他浓度，为轻度抑菌。牡丹皮水提液的浓度在1.00 g·mL-1时对沙门氏菌的抑菌效果好于其他浓度，为轻度抑菌；酯提液浓度在1.00 g·mL-1时的抑菌效果好于其他浓度，为轻度抑菌。整体观察，牡丹皮提取液对金葡菌的抑制作用明显好于沙门氏菌。琥乙红霉素对金葡菌的抑制效果明显好于2种提取液，环丙沙星对沙门氏菌的抑制效果好于2种提取液。

2.5 柴胡的抑菌效果

通过观察测量，柴胡的抑菌情况见表5。

表5 柴胡的不同提取液对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌效果Table 5The antimicrobial effect of different extracts of Radix bupleuri on Staphylococcus aureus and Salmonella

由表5可知，柴胡提取液对金黄色葡萄球菌有抑制作用，对沙门氏菌的作用很弱。柴胡水提液浓度在0.75 g·mL-1时对金葡菌的作用略好于其他浓度，为轻度抑菌；酯提液的浓度在1.00 g·mL-1时对金葡菌的作用略好于其他浓度，为轻度抑菌。柴胡水提液的浓度在1.00 g·mL-1时对沙门氏菌有轻度抑菌效果，其他浓度时无抑菌效果；酯提液浓度在1.00 g·mL-1及0.75 g·mL-1时有轻度抑菌效果，其他浓度时无效果。整体观察，柴胡提取液对金葡菌的抑制作用好于沙门氏菌。琥乙红霉素对金葡菌的抑制效果明显好于2种提取液，环丙沙星对沙门氏菌的抑制效果好于2种提取液。

3 讨论

（1）结果显示黄连的水提及酯提液，黄芩的酯提液及牡丹皮的水提液对金葡菌的抑制作用较好。而且在相同提取方式下，不同浓度的药液效果相差不大。提示提取方式对不同中药效果的发挥至关重要，也为后续寻找单味药及复方制剂的最佳浓度提供了参考。而针对沙门氏菌，5种中药只有黄芩的效果相对较好。其他几种的作用普遍偏低，牡丹皮及柴胡的效果更弱。即使使用环丙沙星作为对照，效果亦不理想。提示此株沙门氏菌的耐药性很强，是否已形成多重耐药菌株则有待进一步证实。通过检测可以在理论上检验常用中药对新近发现分离病原菌的抑制作用，并及时对细菌毒力进行初步评估。还可以为针对目标病原菌的新型药物的研发提供前期基础。

（2）抗生素的出现使得许多严重危害人类及动物的传染性疾病得到了有效控制[5]。但由此出现的耐药性问题，却始终没有得到有效解决。虽然限制抗生素的使用已成为业内共识，但由于片面追求经济效益，现阶段抗生素的应用依然处于过量状态[6-8]。有鉴于此，从传统中医药的角度研发新型药物以替代抗生素就显得尤为迫切。而如何合理研究开发中药资源及制品是目前面临的重大课题。

传统抗生素通过直接抑制或杀死病原菌来对疾病进行治疗[9-11]。这种作用机理给予了细菌强大的选择压力，由此产生并扩大了耐药菌株的范围。目前新型的抗感染策略主要是降低细菌毒力而非直接杀灭[12]。通过选择性地遏制目标菌的黏附及免疫逃避，阻止其毒力表达及毒素传递[13]。以此新型理论为依托，结合中药的自身优势。研制绿色抗毒力小分子干预药物，将成为未来主要的发展方向。

（3）通过与前人在研究对象及方法上的比较。显示在李仲兴[14]的研究中，黄连及黄芩对金葡菌的抑制效果与该研究结果基本相同。其所选中药味数多，金葡菌的样本量大。由此易于筛选效果突出的中药，但工作量过大，标准难于控制。王傲雪[15]针对沙门氏菌所采用的纸片扩散法与该研究相同，研究手段多样并深入微观层面。但就抑菌作用而言，所选中药方向有待商榷。另外在西药抑菌部分，其使用的诺氟沙星对沙门氏菌的效果很好。与研究使用的同类药物环丙沙星差异明显。

研究所选病原菌均为新发菌株，可以反映出中药对其抑制及自身耐药性的最新结果及趋势。所选中药味数较少，有利于效果集中以便构建组方。但实验的方法尚显单一，未深入蛋白基因水平对中药的抗菌机制进行阐明。在针对沙门氏菌的部分，中药作用普遍较低。除了耐药性因素，也要认真体察实验的其他环节。包括菌株的保存，中药提取阶段的方法控制等。以上不足及问题均要在后续研究中予以解决。

（4）接下来针对这2株病原菌尤其是沙门氏菌，拟从以下2个方面进行深入研究：筛选中药单味药及构建复方，对中药制剂如何阻断细菌毒力因子的表达进行阐释[16]；利用中药制剂寻找在细菌致病力发挥过程中具有重要调节功能的蛋白，对中药阻断相关蛋白功能的信号转导通路机制进行阐明[17]。

4 结论

（1）黄连的水提及酯提取液在大部分浓度下对金葡菌有中度抑菌效果；黄芩的酯提液、牡丹皮的水提液及金银花1.00、0.75 g·mL-1时的水提液同样对金葡菌有中度抑制作用。目前金葡菌的耐药性还处于可控范围内，常用中药对其效果较为明显。今后可以在组方阶段予以完善，进一步增强疗效。

（2）黄芩的水提液在1.00 g·mL-1时对沙门氏菌的抑制效果最好，为中度抑菌；其他几种中药则效果偏低甚至无效果。对此株细菌的耐药性发展要密切关注，重点研究其分子致病机制及信号转导通路。

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Inhibition Effect of Chinese Traditional Medicine by Different Extraction Methods on Two Kinds of Pathogenic Bacteria

Fan Zhao1，Chen Yuying2
（1.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Animal Husbandry Bureau of Durbat Monggol County）

To detect the drug resistance of Staphylococcus aureus and Salmonella，different extraction methods were used to prepare coptidis，radix scutellariae，flos lonicerae，cortex moutan，radix bupleuri and the according concentration preparations were made.The antibacterial effect of the isolated two strains of bacteria was determined by Kirby-Bauer method.The results showed that the aqueous extractions and ethyl acetate extractions of Rhizoma coptidis with the majority of concentrations had moderate inhibitory effect on staphylococcus aureus.The extraction of radix scutellariae by ethyl acetate，the extraction of cortex moutan and flos lonicerae by water with the concentration of 1.00 g·mL-1and 0.75 g·mL-1had the moderate inhibitory effect on staphylococcus aureus，respectively.The extraction of radix scutellariae with the concentration of 1.00 g·mL-1by water had the moderate inhibitory effect on salmonella in the best situation.Other Chinese traditional medicine had low effect or no effect.It suggested that this strain of salmonella had very strong resistance.The effect of several kinds of medicine on staphylococcus aureus was relatively better.

staphylococcus aureus；salmonella；Chinese traditional medicine

S853.72

A

1002-2090（2017）03-0029-06

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.03.007

2016-06-21

范钊（1986-），男，助教，东北农业大学毕业，现主要从事中兽医教学及研究工作。