刘鑫喆,王健平,王佳琪,杨薇,黄歆博

(佳木斯大学附属口腔医院，黑龙江 佳木斯 154002)

掺镁-羟基磷灰石对牙周韧带细胞的影响①

刘鑫喆,王健平,王佳琪,杨薇,黄歆博

(佳木斯大学附属口腔医院，黑龙江 佳木斯 154002)

目的：研究新型材料掺镁-磷灰石对牙周韧带细胞的增殖性毒性的影响，以及人牙周韧带细胞对掺镁-羟基磷灰石的黏附性的研究。方法:用体外方法培养人牙周韧带细胞，将不同浓度的掺镁羟基磷灰石(5%Mg—HA，10%Mg—HA)分别与牙周韧带细胞共同培养。对照组为自固化磷酸钙(CPC)，羟基磷灰石(HA)，玻璃离子(GIG)浸提液组。采用MTT法检测细胞毒性以及增殖率。细胞核进行DAPI染色，观察细胞对掺镁羟基磷灰石的黏附情况。结果:MTT检测结果表示为细胞增殖率自固化磷酸钙>5%掺镁羟基磷灰石>10%羟基磷灰石>羟基磷灰石>玻璃离子，各组比较具有显著统计学意义。(P<0.05)每组材料20g/L、40g/L、80g/L浓度之间无统计学意义(P>0.05)。人牙周韧带细胞对材料有一定的黏附性。结论：掺镁羟基磷灰石对牙周韧带细胞有良好的生物相容性，毒性小，有一定的促进牙周韧带细胞黏附作用。为髓室底穿，根管侧穿的修复工作提供了新的选择。

掺镁-羟基磷灰石；牙周韧带细胞； 髓室底穿材料；生物相容性；细胞毒性

在临床根管治疗过程中，由于髓腔解剖的变异或操作者对髓腔的解剖知识了解不足，经常会遇到髓室底穿根管侧穿的问题[1]。因为髓腔位置隐蔽、视野差、对医生技术、修补材料要求较高，并且髓腔穿孔位置涉及到牙周组织和牙体组织，修补材料需要严密的封闭能力，以及良好的生物相容性，才能恢复牙周、牙体组织的健康。良好的修补材料，将很大程度的决定牙髓治疗的成败。羟基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2,HA]与牙体硬组织的无机成分极其相似，具有良好的生物相容性[2]。 为了更好的满足临床的需要,常常在人工合成的HA中添加一些元素来改善其临床性能,含镁羟基磷灰石(Mg-HA)就是其中的一种改新型的性材料[3]。据有关文献记载，镁在骨形成的初期具有重要作用，镁可以提高成骨细胞的活性，镁的缺乏可影响骨的代谢导致骨质疏松[4]。因此本实验研究掺镁-羟基磷灰石对牙周韧带细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DMEM培养基(HyClone生物化学制品有限公司);PBS(HyClone生物化学制品有限公司)胶原酶(TypeI,美国Gibco公司);胰蛋白酶(美国Gibco公司);胎牛血清(四季青生物工程公司);青链霉素溶液(双抗)(HyClone生物化学制品有限公司)。

掺镁羟基磷灰石(佳木斯大学材料学院)镁的质量分数分别为5%，10%，本文5%Mg—HA为5Mg-HA,10%Mg—HA为10Mg-HA，不再赘述。共分5组，其中5Mg-HA、10Mg-HA为实验组，对照组为玻璃离子，羟基磷灰石，自固化磷酸钙。采用DMEM培养液配制各组材料浸提液，每组材料分别配置为80，40, 20g/L浸提液。

1.2 细胞的原代培养

经患者同意，取14～26岁的正畸拔除的双尖牙(佳木斯大学附属二院口腔颌面外科)牙齿拔出后，立即置于预冷4℃的含青霉素、链霉素的无血清DMEM培养液中。在超净台无菌条件下,用不含血清DMEM与PBS交替冲洗牙根部数遍,用手术刀轻柔地、向一个方向刮取牙根中1/3部位的牙周膜组织，将牙周膜组织分离成 1mm2左右的小组织块。以1cm的间距分散摆放在细胞培养瓶底。缓慢轻柔将细胞培养瓶倒置，小心缓慢加入5mL含20%胎牛血清的DMEM培养液，置于饱和湿度，37℃的CO2孵箱内培养，4h后缓慢反转培养瓶，使液体浸没组块，继续培养。3～4d后，发现有细胞从组织边缘爬出时，首次细胞换液。后每3～4天换液。待细胞有70%以上出现融合时，进行传代培养。取 4～6代的细胞进行实验。

1.3 方法

①MTT检测细胞毒性：将牙周韧带细胞接种于96孔培养板，每孔加入100μL的细胞悬液，细胞浓度为1×104个/mL，每组每浓度重复种植6个孔。在96孔板的四周加PBS液10μL，以保持96孔板的湿度。人牙周韧带细胞在96孔细胞培养板中培养48h后,吸出原培养液,按上述分组加药,每组分别设置6个复孔,37℃下继续培养分别于1d、3d、5d、7d。其中3d组、5d组、7d组需每隔一天用对应浸提液换液1次，取出待测的96孔板，取浸提液与细胞作用的培养板，每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL，37℃，体积分数为0.05的CO2饱和湿度环境下继续培养4h，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入DMSO150μL，震荡10min，酶联免疫检测仪570nm波长下测定各孔光吸收值，用单纯培养液调零，取平均值。计算细胞相对增殖率。

②牙周韧带细胞黏附性试验：在细胞复合培养至第5、7天，取出细胞与材料，将各组材料制成直径为10mm,高3mm的扁圆片状试件。羟基磷灰石组为对照组。接种的细胞甲醛固定，每孔加入新鲜配制DAPI染液进行染色，并固定于载玻片，共聚焦激光荧光倒置显微镜下，用数码摄像系统观察并拍照观察细胞核数量。

1.4 统计学方法

采用SPSS20.0数据分析软件，进行方差分析和LSD的两两比较，以P<0.05为检验水准。

2 结果

2.1 不同浓度、不同时间下、牙周韧带细胞增殖数目，不同浓度比较，不同浓度之间比较无统计学差异(P>0.05)。见图1，不同时间点比较，1d和5d，3d和7d有统计学差异， 1d、3d比较(P<0.05)，1d和5d比较(P<0.01)，1d和7d比较(P<0.01)………组别之间俩俩比较均有意义。五组材料细胞增值率

为自固化磷酸钙>5%掺镁羟基磷灰石>10%掺镁羟基磷灰石>纯羟基磷灰石>玻璃离子。

图1 牙周韧带细胞增殖时间趋势图

2.2 细胞黏附性DAPI染色结果所示，随着培养时间的增加，各组材料上的细胞数量有所变化。可以明显看出，培养5，7d后，牙周韧带细胞均正常黏附于各组材料，其中10Mg-HA培养7d后细胞数量染色较5d后有明显的增多。5Mg-HA试件上的细胞在5d达到峰值。

图2 人牙周韧带细胞种植到各组材料上5d.7d.的DAPI染色免疫荧光(免疫荧光染色×100)

3 讨论

众所周知，髓室底穿根管侧穿是根管治疗常见的并发症，其修复难度高，成功率低是困扰口腔医师的常见问题。髓室底穿根管侧穿对操作者的技术要求以及修补材料的性能的要求尤为严格,理想的修补材料须具有杰出的生物相容性,可激活成骨细胞成牙本质细胞，促进修复性牙本质的形成，封闭髓腔与根周组织的交通，形成良好的封闭。髓室底穿根管侧穿修补材料因直接与牙周组织接触,其生物相容性对牙周组织的恢复重建更为尤为重要。在国际惯例中，一种新型的口腔修补材料在临床应用之前首先进行生物相容性的评价。MTT法是细胞毒性检测的一种重要手段，该方法可以准确、迅速、灵敏地反映细胞增殖程度和细胞毒性程度， 此比色法是用于评价新型材料细胞毒性的最常用实验方法之一，广泛适用于各种新型材料生物相容性的评价。MTT染色后吸光度值比较，表明掺镁羟基磷灰石与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.05)，说明掺镁羟基磷灰石符合生物体应用的基本要求，据大文献所述,传统的氧化锌、氢氧化钙、玻璃离子、对治疗髓室底穿有一定效果,但长期效果均不理想，可造成局部组织坏死，渗出。近期大量文献报道MTA,具有良好的生物相容性、可关闭缺损部位及临床可操作性，并且在湿润环境下可以固化，但价格昂贵。据实验表明MTA可以激活大量的成骨细胞，成骨细胞分泌类骨质成为骨细胞并被包埋于新骨之中，MTA中含有钙、磷等元素，它与水反应后的产物含有氧化钙和磷酸钙的成分，氧化钙与水反应形成最终形成氢氧化钙。掺镁羟基磷灰石镁的掺入使羟基磷灰石更接近人体自然骨组织中天然羟基磷灰石的组成。镁作为骨组织中羟基磷灰石的阳离子替代物在骨形成早期，因镁、钙离子之间的离子互换规律，镁提高了成骨细胞的活性，而骨成熟后基本消失[5]。镁的缺乏症可导致骨质疏松，主要是因为通过抑制成骨细胞的数量、迁徙、分化和增加破骨细胞的数量[6～9]。掺镁羟基磷灰石对髓室底穿部促进新骨形成，对牙周韧带细胞生物相容性良好。由此可见掺镁羟基磷灰石与MTA都可以诱导引导牙骨质类牙骨质，以及可利于牙周韧带细胞的黏附，良好的生物相容性，这将是牙周组织重建不可取代的因素。因此,掺镁羟基磷灰石作为乳、恒牙髓室底穿的屏障和修复材料是可行的,为最大限度地保存患牙,并恢复其生理功能提供了一种新型材料。

[1]刘祝成.髓底穿孔修补术的临床观察[J].黑龙江医药科学，2011,34(2)：111

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[4]史月华，谷志远，郑园娜.掺镁羟基磷灰石涂层对种植体骨结合的影响[J].口腔医学，2014，34(4)：249-252

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佳木斯大学研究生科技创新项目，编号:LM2016_075。

刘鑫喆(1990～) 女，黑龙江牡丹江人，在读硕士研究生。

王健平(1959～) 男，黑龙江佳木斯人，硕士，教授，硕士研究生导师。E-mail:826452916@qq.com。

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1008-0104(2017)02-0047-02

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