陈晓艳 孟亚雄 贾小霞 张武 刘石 郭玉美 齐恩芳

摘要： 该研究为了培育兼抗4种病毒的马铃薯品种，采用RTPCR技术对PVX、PVS、PVY和PLRV的外壳蛋白（CP）基因进行克隆与分析，获得了大小分别为670、800、700、600 bp的CP基因序列，将获得的CP基因序列与NCBI中已报道的序列进行比对分析，其同源性都在96%以上。根据所克隆的CP基因对靶标片段进行筛选，获得了大小约300 bp的靶标片段PVXrh、PVSrh、PVYrh和PLRVrh，同时利用 OverlapPCR技术将4种病毒的靶标片段进行拼接，得到了长度约为1 200 bp的融合片段XSYVrh，与预期目标片段XSYVyxz的相似性达100%。利用DNA重组技术将融合片段XSYVrh克隆到pGMT载体上构建成克隆载体pGMTXSYVrh，用SpeⅠ和SacⅠ对克隆载体pGMTXSYVrh和植物表达载体pART27进行同步双酶切，用T4 DNA连接酶将XSYVrh片段连接到载体pART27上，成功构建了同时含4种病毒CP基因片段的植物表达载体pART27XSYVrh。采用直接转化法将植物表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中，并利用农杆菌介导法对烟草品种T12试管苗进行遗传转化，转化后的烟草植株经PCR检测，有40株转化植株可扩增出目的条带，表明XSYVrh融合基因已成功转入烟草基因组中。

关键词： 马铃薯病毒， 融合基因， 载体构建， 遗传转化， 转基因烟草

中图分类号： S532

文献标识码： A

文章编号： 10003142（2017）01008709

Abstract： In order to simultaneously foster antifourvirus potato varieties（PVX， PVS， PVY and PLRV）， four different viral coat protein （CP） gene PVXCP （670 bp）， PVSCP（800 bp）， PVYCP（700 bp） and PLRVCP（600 bp） were obtained via RTPCR and sequenced to confirm respectively. And the comparison of the sequences that we obtained and the already reported sequences from NCBI database showed that all four viral CP genessequences were more than 90% homologous； then around 300 bp size conservative gene fragments PVXrh， PVSrh， PVYrh， PLRVrh were selected from their respective viral CP genesand four specific bands which were consistent with the fragment size were obtained via PCR amplification. The fusion sequence XSYVrh which is around 1 200 bp long was created with PVXrh， PVSrh， PVYrh and PLRVrh gene fragments via OverlapPCR technique. With the help of DNA recombination technique， we integrated XSYVrh sequence into pGMT vector and created cloning vector pGMTXSYVrh. The cloning vector pGMTXSYVrh and the plant expression vector pART27 were treated with incision enzyme Spe Ⅰ and Sac Ⅰ； then under the effect of T4 DNA ligase， XSYVrh sequence was integrated with pART27 expression vector； at last pART27XSYVrh plant expression vector was successfully constructed. The pART27XSYVrh plant expression vector was introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404， and subsequently introduced into tobacco （T12） assisted by the agrobacteriummediated transformation. PCR results showed that there were 40 transgenic plants with targeted gene integrated into their genomes.

Key words： potato virus， fusion gene， vector construction， genetic transformation， transgenic tobacco

馬铃薯（Solanum tuberosum）为茄科（Solanceae）茄属（Solanum）一年生草本块茎植物，起源于秘鲁、哥伦比亚及玻利维亚安第斯山区，在哥伦布发现新大陆后从原产地迅速向世界各地传播种植，目前马铃薯种植已遍布全球（李婷婷，2014）。马铃薯作为仅次于小麦、水稻和玉米的第四大粮食作物，在农业生产中有着其他作物不可替代的作用（张丽等， 2015）。近年来，随着马铃薯产业迅速发展，对其品质和产量等要求也不断提高，但马铃薯病毒病也日趋严重，且已成为马铃薯退化和减产的重要原因（朴福万，2010；吴兴泉等，2011）。马铃薯病毒病分布于世界各马铃薯种植区，目前已报道侵染马铃薯的病毒有40余种（Grammatikaki et al，2007），其中危害较重的主要有马铃薯卷叶病毒（Potato leaf roll virus，PLRV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）、马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）、马铃薯S病毒（Potato virus S，PVS）、马铃薯M病毒（Potato virus M，PVM）、马铃薯A病毒（Potato virus A，PVA）和马铃薯纺锤块茎类病毒（Potato spindle tuber viroid，PSTV）等（马雪青等，2010）。单独一种马铃薯病毒一般可导致马铃薯减产10%～30%，严重者在80%以上（Salazar et al， 1978）。如PLRV在我国北方地区造成的马铃薯产量的损失为30%～40%，严重时候为80%～90%（霍晓辉等，2013）；PVY严重时减产在80%以上（Glais et al，2002；Nolte et al，2004；Whitworth et al，2006；常飞等，2015）；PVS可减产10%～20%，该病毒不易觉察，主要靠接触传毒，通过热处理及茎尖脱毒技术都较难脱除干净，分布于世界各马铃薯种植区（吴兴泉等，2015）；PVX单一侵染症状轻微或潜隐，一般减产10%左右，有时可达50%（姚东校等，2013）；马铃薯感染PVA后可造成40%的减产（张维，2013）。而2种甚至几种病毒混合侵染带来的损失远大于各病毒单独侵染（崔晓江等，1994），如PVY和PVX或PVY和PLRV混合侵染带来的的损失远远大于各病毒单独侵染（崔晓江等，1994）。因此，培育抗病毒马铃薯品种是防治病毒病的有效方法。

马铃薯是同源四倍体作物，用常规育种方法改良品种，天然抗性基因资源严重不足，且存在育种周期长、抗性基因遗传不稳定以及远缘杂交种间障碍等问题，而随着细胞工程和现代生物技术的发展，转基因技术可将外源的一个或多个基因转入植物的基因组中，实现植物遗传性状的定向改变，为作物新品种的培育提供了新途径。自20世纪80年代由农杆菌介导的第一例转基因马铃薯植株问世以来，转基因技术在马铃薯育种上已取得了较大进展（明镇寰和Ooms，1991）。目前已获得抗PVX，PVY，PLRV等转外壳蛋白（CP）基因的抗性植株（龚磊，2013）。随着分子生物技术的发展，利用OverlapPCR等基因融合技术培育出了能抗2种或3种病毒的转基因马铃薯（宋艳茹等，1994）。因此，利用基因工程技术向植物体内导入外源基因是抗病毒病的一种有效途径。本研究首先用RTPCR法克隆了PVX、PVS、PVY和PLRV的CP基因全序列，同源比对分析CP基因的保守区域后，扩增出4种病毒CP基因300 bp左右较保守的基因片段，然后利用 OverlapPCR技术将4种病毒的CP基因片段进行拼接，构建了pART27XSYVrh植物表达载体，进一步转化烟草，以期培育兼抗4种病毒的植物新材料。

1材料与方法

1.1 材料

植物材料：PVX、PVS、PVY和PLRV带毒马铃薯试管苗葉片。菌株：pGMT vector和大肠杆菌菌株DH5a购自TaKaRa公司。其余菌株由本实验室保存。

试剂：Taq酶、各种限制性内切酶、氨卞青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、IPTG、Xgal等均购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、植物RNA提取试剂盒购自TIANGEN公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；测序由赛百盛公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物设计参考NCBI中已报道的PVX（Z34261.1）、PVS（GU319954.1）、PVY（X54611.1）和PLRV（AY307123.1）CP基因全长序列，利用Premier5.0设计克隆4种病毒CP基因长度分别为PVX（670 bp）、PVS（811 bp）、PVY（701 bp）、PLRV（584 bp）的引物（表1），用oligo6.0软件评估。根据已克隆的4种CP 基因的 cDNA 序列，选择各序列中约300 bp无终止突变，且拼接后也无终止突变的基因片段（将拼接的目的片段命名为XSYVyxz），利用Oligo6.0软件进行引物设计，考虑到后续片段融合需要，在设计引物时加入Spe I和Sac I酶切位点，最终设计各片段的重叠引物（表2）。

1.2.2 CP基因的克隆RNA的提取与cDNA的合成：参照RNA提取试剂盒说明，提取感染病毒的马铃薯叶片总RNA。利用RNA反转录试剂盒反转录合成cDNA第一链。

PCR扩增：以cDNA为模板，分别以FX/RX、FS/RS、FY/RY、FV/RV4对引物对4种CP基因进行PCR扩增。反应体系25 μL：5×Primes STAR Buffer（Mg2+plus）5.0 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol·L1）2.0 μL，上下游引物（10 mmol·L1）各0.5 μL，下游引物R（10 mmol·L1）0.5 μL，模板（cDNA）0.5 μL，Prime STAR HsDNA Polymerase 0.25 μL，用ddH2O补至25 μL。反应程序：98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 60 s，循环30次；循环结束后，按暂停按钮，每个PCR管各加0.5 μL Taq DNA polymerase，最后72 ℃保温10 min。

扩增产物的回收、测序与序列比对：扩增产物经1.0%（w/v）琼脂糖凝胶电泳检测后，用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化，纯化产物与PGMT载体连接转化DH5a感受态细胞。利用蓝白斑筛选阳性克隆，提取质粒进行PCR及EcoR I酶切鉴定，最后进行基因测序。测序结果用DNAMAN5.0软件分别与4个CP基因全长序列进行比对。

1.2.3 靶标基因片段PVXrh、PVSrh、PVYrh和PLRVrh的扩增以提取的质粒为模板，分别用四对引物（PVX1/PVX2、PVS1/PVS2、PVY1/PVY2和PLRV1/PLRV2）对4种靶标基因进行PCR扩增。方法同1.2.2。

1.2.4 目标基因片段XSYVrh的融合反应体系25 μL，包含5×Primes STAR Buffer（Mg2+plus）5.0 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol·L1）2.0 μL，Template1（纯化DNA）0.5 μL，Template2（纯化DNA）0.5 μL，Prime STAR HsDNA Polymerase 0.25 μL，ddH2O 16.75 μL， PCR扩增条件为98 ℃ 10 s， 55 ℃ 5 s， 72 ℃ 60 s，循环5次；5个循环结束后，按暂停，加入上游引物PVX1（10 mmol·L1）和下游引物PVS2（10 mmol·L1）各0.5 μL，再按98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 60 s，循环30次，按暂停，给每个PCR管各加0.5 μL Taq DNA polymerase，最后72 ℃ 10 min，扩增出融合基因XSrh，回收产物-20 ℃保存。同样的方法扩增出融合基因XSYrh和XSYVrh。

1.2.5 融合片段的克隆、检测、测序与分析将融合片段PCR扩增产物经1.0%（w/v）琼脂糖凝胶进行切胶回收，将回收产物与pGMT载体连接，连接产物转化DH5a感受态细胞。在含有100 mg·L1 Amp的LB平板上利用蓝白斑筛选阳性单菌落进行接种培养后，碱裂解法提取质粒，经PCR及酶切鉴定后，取一只甘油管送赛百盛公司进行测序。测序结果用DNAMAN5.0软件与目标基因片段XSYVyxz进行比对。

1.2.6 植物表达载体pART27XSYVrh的构建及鉴定分别提取含目的基因XSYVrh和载体pART27的质粒，用Spe I和Sac I对提取的质粒进行同步双酶切，用40 μL酶切体系：包含1 μL Spe I，1 μL Sac I，4 μL 10×M Buffer，20 μL质粒，ddH2O补足40 μL。反应条件为37 ℃过夜，回收酶切产物小片段命名为XSYVrh，大片段命名pART27。用T4 DNA连接酶将XSYVrh片段连接到载体pART27上，用10 μL连接体系： 包含1 μL T4 DNA ligase Buffer， 1 μL T4 DNA ligase，3.5 μL目的片段XSYVrh，1 μL载体pART27，ddH2O补至10 μL。反应条件为16 ℃过夜，连接产物转化DH5a感受态细胞，在含有50 mg·L1 Kan的LB平板上挑取阳性单菌落进行接种培养后，进行菌液PCR检测，提取质粒后用Spe I和Sac I双酶切鉴定，1.0%琼脂糖电泳检测片段长度进而验证含有目的基因片段的植物表达载体pART27XSYVrh的正确性。

1.2.7 pART27XSYVrh植物表达载体转化根癌农杆菌LBA4404根癌农杆菌感受态细胞的制备：从-80 ℃冰箱取一支根癌农杆菌LBA4404感受态甘油管，冰浴融化，然后在含有20 mg·L1 Rif和50 mg·L1 Str的YEP平板上划线，倒置平板，28 ℃培养1～2 d；挑取LBA4404单菌落接种于同样的YEP液体培养基中继续培养至OD600值为0.3～0.4；转入无菌的离心管中，置于冰浴中30 min；4 ℃，5 000 r·min1离心5 min后去掉上清液；加入2 mL预冷的20 mmol·L1 CaCl2重悬菌体；制备好的感受态按照200 μL分装于无菌的离心管中，液氮速冻后置于-80 ℃保存备用，使用时取出置于冰上融化。

植物表达载体pART27XSYVrh转化根癌农杆菌感受态细胞LBA4404：取2 μg（5～10 μL）质粒DNA，加入200 μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀；置于冰上30 min，转入液氮中5 min，迅速置于37 ℃水浴中5 min；加入800 μL YEP液体培养基，28 ℃下250 r·min1预表达4～5 h；取100～200 μL菌液涂布于含有20 mg·L1 Rif、50 mg·L1 Str和50 mg·L1 Kan的YEP固体平板上静置5～10 min后，倒置平板，28 ℃下暗培养2 d。

农杆菌LBA4404pART27XSYVrh鉴定：挑取阳性单克隆，重新扩繁菌液，进行菌落PCR鉴定。

1.3 含XSYVrh融合基因烟草植株的获得及初步筛选

1.3.1 烟草无菌苗的培养70%乙醇消毒T12烟草种子30 s后，用无菌水清洗2～3次，再用0.1%的HgCl2消毒8min，用无菌水清洗6～10次；将消毒后的种子置于MS固体培养基中，于25～26 ℃，14 h光照/10 h黑暗条件下萌发。14 d后将萌发出的T12烟草幼苗转移至含有MS培养基的培养瓶中，相同条件下培养4～6周，其生长正常细嫩叶片可用于遗传转化。

1.3.2 农杆菌工程菌菌液的准备将农杆菌工程菌LBA4404pART27XSYVrh接种在含20 mg·L1 Rif、50 mg·L1 Str和50 mg·L1 Kan的YEP固体培养基，于28 ℃条件下避光培养2 d后挑单菌落接种到同样的YEP液体培养基中，于28 ℃、260 r·min1条件下避光振荡培养24～36 h。将活化好的菌液按1∶50进行放大培养，至OD600值为0.5。将达到對数生长期的菌液倒入50 mL无菌的离心管中，5 000 r·min1，离心10 min，弃上清，用MS液体培养基（pH7.0）重悬菌体。

1.3.3 农杆菌转化烟草的方法烟草叶片不进行预培养，在无菌条件下将烟草试管苗的成熟叶片剪去主脉和叶边缘，再剪成0.5～1.0 cm2的小块置于小烧杯中，倒入重悬好的菌液，使叶片与农杆菌充分接触，侵染8～10 min，其间不断摇动小烧杯，保证侵染均匀。时间到后，将菌液倒掉，用无菌水冲洗3次。先夹出叶片，再用无菌滤纸吸去叶片周围多余的菌液，以叶片上表面接触培养基，将叶片接到共培养基（MS + 6BA 1.0 mg·L1）中，每皿8～9片，培养皿用封口膜封口，倒置，28 ℃暗培养72 h左右，当看到叶片与培养基接触边缘长出一圈白色农杆菌时，先用无菌水清洗3次，之后用MS液体培养基洗涤2次，再用无菌滤纸吸干叶片表面的液体后，最后将叶片转入添加有一定浓度Kan和Cb的芽诱导培养基（MS + 6BA 1.0 mg·L1 + Kan 100 mg·L1 + Cb 500 mg·L1）中，置于温度（22±1）℃、光照强度3 000 lx，光照时间14 h·d1条件下培养20 d左右。

1.3.4 转基因烟草抗性筛选待长出1～2 cm的诱导芽后，将诱导芽小心转入到Kan减半并加有Cb的生根培养基（1/2MS + Kan 50 mg·L1 + Cb 300 mg·L1）中诱导生根并扩繁，直到长成完整植株。

1.3.5 转基因烟草的PCR检测利用植物基因组DNA小量提取试剂盒，提取转基因烟草植株的基因组DNA。参照方法1.2.3进行PCR扩增检测。

2结果与分析

2.1 外壳蛋白基因的克隆及酶切鉴定

以PVXCP、PVSCP、PVYCP、PLRVCP的cDNA为模板，FX/RX、FS/RS、FY/RY、FV/RV4对引物进行PCR扩增，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，观察到4条大小分别为670、800、700、600 bp左右的片段，条带大小与预期的片段大小一致（图1：A）。进一步比对得出，这4条序列与NCBI中已公布的PVX、PVS、PVY和PLRV四条片段的同源性在96%以上。将扩增产物回收纯化后与pGMT载体连接，连接产物转化DH5a感受态细胞，斑筛选阳性克隆，提取4种质粒后对4种质粒进行EcoR I酶切，酶切结果表明：切出的条带大小与预期的片段大小相符，如图1：B所示。将鉴定正确的质粒分别命名为pGMTX、pGMTS、pGMTY、pGMTV。

2.2 目的片段XSYVrh的融合

2.2.1 目标基因片段PVXrh、PVSrh、PVYrh、PLRVrh的扩增按照1.2.3所述方法中的PCR扩增反应程序体系，分别以pGMTX、pGMTS、pGMTY、pGMTV质粒为模板，将PVX1/PVX2、PVS1/PVS2、PVY1/PVY2、PLRV1/PLRV24对引物进行PCR反应，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，观察到4条300 bp左右大小的条带，其大小与预期片段大小符合，如图2所示。将PCR产物进行纯化回收，分别命名为PVXrh、PVSrh、PVYrh、PLRVrh。

2.2.3 融合基因片段XSYVrh的酶切检测将XSYVrh扩增产物回收纯化后连接pGMT载体，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞， 利用蓝白斑筛选5个阳性克隆， 对菌液进行PCR检测， PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测得到1 200 bp左右大小的片段（图4：A），从图中挑选一个条带最亮最好的用碱裂解法从该条带所对应菌液中提取质粒，命名为XSYVrh。对该质粒XSYVrh进行PCR检测和Spe I、Sac I双酶切检测，PCR产物和酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，均可分别观察到1 200 bp左右的条带（图4：B，C）；该序列的测序结果表明：其大小与理论预期筛选出的无终止突变的约1 200 bp基因序列大小、顺序均一致，相似度达100%，可以判断四个片段已经按照预期融合在一起。

2.3 植物表达载体pART27XSYVrh的构建及其PCR和酶切鉴定

植物表达载体pART27XSYVrh构建过程如图5所示。转化大肠杆菌DH5a后，提取质粒，进行PCR检测，扩增出1 200 bp左右的目的条带（图6：A）。双酶切后可见约1 200 bp的目的条带和线性载体（图6：B），说明pART27XSYVrh植物表达载体构建成功。

2.4 农杆菌介导的LBA4404pART27XSYVrh转化及PCR鉴定

将构建好的表达载体转化根癌农杆菌，挑取阳性克隆，对菌液进行PCR鉴定，特异扩增出约1 200 bp的目标条带（图7）。结果表明，构建的植物表达载体已成功转入根癌农杆菌LBA4404。

2.5 转基因烟草的获得及PCR检测

阳性单菌落用于烟草转化，其筛选过程中抗性苗的获得如图8所示。工程菌浸染后的叶片经共培养、选择培养及生根培养后，得到无菌抗性苗60株。以引物PVX1/PLRV2进行PCR检测，结果表明阳性对照（质粒pART27XSYVrh）和40株转化植株扩增出约1 200 bp大小的片段，而空白对照（ddH2O）、阴性对照（未转化烟草）没有扩增出任何片段（图9为PCR检测的部分结果），初步证明XSYVrh融合基因已转入烟草中。

3讨论与结论

近年来， 利用病毒来源的基因获得抗性转基因植物已成为植物抗病毒育种的重要途径。科学研究表明，表达病毒CP基因的转基因马铃薯能显著延缓该病毒病害症状的发展并减轻其危害程度（A Hoekema et al，1989）。自1986年Abel et al （1986）

首先将烟草花叶病毒（TMV）的CP基因导入烟草获得抗TMV的转基因烟草以来，利用病毒的CP基因防治植物病毒病的例子已有许多，李奇科等（2009）利用马铃薯Y病毒（PVY）的CP基因获得了稳定、高效的抗病效果。美国孟山都公司最先获得同时表达PVX和PVY CP基因的双价转基因马铃薯（Lawson et al，1990）。宋艳茹等（1994）首次获得PVY+PLRV的转基因马铃薯株系。崔晓江等（1994）通过构建载体获得了同时抗PVY、PVX和PLRV的转3基因马铃薯。但是，目前還未见转4价病毒CP基因马铃薯的报道，而多个基因构建在不同载体上转入同一受体会因为载体间的相互影响而导致效率降低。本研究利用重叠延伸PCR技术将PVX、PVS、PVY和PLRV外壳蛋白基因通过末端互补、重叠延伸进行体外重组连接，得到了融合基因片段XSYVrh，测序结果与预期XSYVyxz序列完全

一致，表明4种病毒外壳蛋白基因融合成功。用农杆菌介导法转化的烟草中，在获得的转基因烟草中，PCR检测证明XSYVrh基因已整合到烟草基因组中，因而为该载体的进一步广泛应用打下了基础，希望借此获得同时抗4种病毒的转基因植物材料。若要从转基因植株的抗性基因的拷贝、调控表达与功能等方面进行研究，还要做Southern Blot、Northern Blot以及Western Blot，对转入基因进行全面了解，对其相应的蛋白功能做全面研究。目前，实验室正在对获得的抗性烟草植株进行GUS瞬时表达检测，以及蛋白分析与表达产物的生物活性检测试验都仍在进行之中。

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