单敏　李涛　何晶　李文海　王小兰　罗荣廷　于圣青

摘要：[目的]了解鸭疫里默氏杆菌AS87-01740基因分子生物学特性，确定其编码蛋白抗原性，为鸭疫里默氏杆菌亚单位疫苗研发提供新的靶标抗原选择。[方法]采用PCR克隆鸭疫里默氏杆菌AS87-01740基因，以DNASTAR和NCBI数据库分别进行基因生物信息学分析；利用pCold-TF原核表达载体在大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达，并分别以SDS-PAGE和Westemblotting检测融合蛋白的表达形式及其抗原特异性。[结果]从鸭疫里默氏杆菌基因组扩增获得的AS87-017405因编码框全长618bp，编码205个氨基酸，理论分子量约21.87kD，理论等电点（pI）8.2，正电荷氨基酸总数17个，负电荷氨基酸总数16个。AS87—01740蛋白序列在同种属分离株中，与2型血清型分离株（11845、YM、GD和CH-2）有很高的相似性（>99%），与1型血清型分离株（cH一1和CH-3）的相似性为92%；在不同种属中，与金黄杆菌（Chryseobacteriumsp.）、动物溃疡伯格菌（Bergeyellazoohelcum）和脑膜炎败血伊丽莎白菌（Elizabeth-kingiameningosepticum）的相似性分别为61%、60%和57%。经异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达获得的融合蛋白分子量约77kD，以可溶性表达形式为主。Westemblotting检测结果表明，融合蛋白能与鸭疫里默氏杆菌阳性血清发生特异性免疫反应。[结论]AS87-01740基因编码蛋白在不同鸭疫里默氏杆菌分离株中具有很高的保守性，且能与其阳性血清发生特异性免疫反应，是研发鸭疫里默氏杆菌疫苗的潜在抗原。

关键词：鸭疫里默氏杆菌；AS87-01740基因；生物信息学；原核表达；免疫原性

中图分类号：S852.612 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）11-2058-06

0引言

[研究意义]鸭疫里默氏杆菌（Riemerellaanatipes-tifer，RA）为革蘭氏阴性菌，隶属于黄杆菌科（Flavo-bacteriaceae），主要引起鸭、火鸡、鹅等禽类急性或慢性败血症，以2-3周龄禽类最易感，其临床症状以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎等炎症为主，也有部分病鸭表现出神经症状、干酪性输卵管炎和生长障碍（岳嘉蘋等，2014）。自1982年我国首次暴发鸭疫里默氏杆菌病以来，因其发病范围广、死亡率高，已成为危害养鸭产业的主要细菌性疾病之一，给我国养鸭业带来巨大经济损失（郭玉璞等，1982；苏敬良等，1999）。至今，国际上已报道的鸭疫里默氏杆菌共21种血清型（程安春等，2003），由于其血清型复杂，且各血清型问几乎无交叉免疫保护力，从而限制了灭活疫苗的推广应用。因此，寻找有效抗原蛋白研制鸭疫里默氏杆菌疫苗是保障养鸭产业健康发展的关键。[前人研究进展]目前，文献报道的鸭疫里默氏杆菌有效抗原主要有荚膜（含己糖胺）、外膜蛋白（Omp）、VapD蛋白、潜在表面蛋白（P45）和DNA复制蛋白等。苏敬良等（1998）分别制备荚膜粗提物和经苯酚抽提纯化的荚膜产物，经免疫接种试验证明，二者对鸭疫里默氏杆菌病的保护率分别为90%和70%，且前者抗体水平下降速度低于后者。Subra-manian等（2000）首次从鸭疫里默氏杆菌野毒株、ATCC株Omp蛋白中鉴定出保守且具有抗原性的外膜蛋白A（OmpA）。Huang等（2002）分别对血清15型鸭疫里默氏杆菌的OmpA基因和血清19型鸭疫里默氏杆菌表面蛋白进行原核表达，经ELISA检测发现这两种重组蛋白均具有一定的免疫原性。Hu等（2011）通过自杀性质粒同源重组的方法构建缺失OmpA基因的血清1型鸭疫里默氏杆菌CH3AOmpA株，结果发现该缺失株的粘附入侵能力明显降低，故推断OmpA基因参与鸭疫里默氏杆菌对宿主的粘附和侵袭感染过程，可能是重要的毒力因子。徐盼（2014）通过原核表达鸭疫里默氏杆菌OmpA基因，证实OmpA蛋白具有免疫原性，能够刺激宿主产生体液免疫和一定的细胞免疫。雷云等（2016）基于Om-pA基因对从贵州分离获得的12株鸭疫里默氏杆菌进行系统进化分析，结果显示12株鸭疫里默氏杆菌可分为两大群，其OmpA蛋白中有规律的变异位点为100（R/G）、143（S/P）、145（m/I）和268（S/P）。Somu等（2016）通过比较印度喀拉拉地区和我国台湾地区鸭疫里默氏杆菌的Omp蛋白，结果显示这两个地区鸭疫里默氏杆菌分离株的Omp蛋白序列无显著差异，故Omp蛋白可作为检测鸭疫里默氏杆菌的有效靶标蛋白。[本研究切入点]因鸭疫里默氏杆菌血清型较多，现有的疫苗保护率差（王小兰，2015），而亟需寻找新的抗原蛋白。本课题组前期通过随机突变库筛选法，筛选得到一株毒性明显下降的突变菌株（LDso约是野生株的1/300），经测序发现其突变基因为AS87-01740基因，基因编码蛋白属于外膜蛋白家族（OMPs），至今国内外尚无有关该基因的研究报道。[拟解决的关键问题]对编码鸭疫里默氏杆菌表面蛋白的AS87-01740基因进行克隆及原核表达，确定其编码蛋白抗原性，以期为鸭疫里默氏杆菌亚单位疫苗研发提供新的靶标抗原选择。

1材料与方法

1.1试验材料

鸭疫里默氏杆菌由中国农业科学院上海兽医研究所保存提供；pCold-TF载体购自TaKaRa公司；异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）、普通质粒小提试剂盒及大肠杆菌DH5a、BL21（DE3）感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司；蛋白质分子质量标准、胶回收试剂盒购自Fermentas公司；His标签纯化磁珠购自瑞士Biotool公司。

1.2引物设计与合成

根据GenBank中的鸭疫里默氏杆菌CP007204.1基因序列，用PrimerPremier5.0进行引物设计，引物两端分别添加EcoRⅠ和XhoⅡ酶切位点（下划线部分）及保护性碱基（小写字母），扩增目的片段大小为595bp。其中，上游引物为5'-actGAATTCATGAAAAAATTATTTTTAGGATTAGCGG-3'，下游引物为5'-agcCTCGAGGAATTTAACTCCTAAACCTACTTGG-3。引物由上海英潍捷基公司合成。

1.3目的基因克隆

使用基因组提取试剂盒提取菌株基因组用作PCR扩增DNA模板。PCR反应体系50.0μL：2×TaqMix25.0μL，DNA模板2.0μL，上、下游引物各1.0μL，灭菌双蒸水21.0μL。扩增程序：95℃预变性5min；95℃1min，52℃1min，72℃40s，进行30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定后切胶，并回收目的片段。

1.4目的基因测序及进化树分析

采用DNASTAR和NCBI数据库分别进行AS87-01740基因生物信息学分析，并以MAGA7.0构建AS87-01740蛋白系统发育进化树。

1.5表达载体构建及鉴定

AS87-01740基因全长片段及pCold-TF载体用EcoRI和XholI进行双酶切，回收酶切目的片段并重组，以重组质粒pCold-AS87-01740转化DH5a感受态细胞，涂布于含氨苄的LB琼脂培养基上，37℃过夜培养；次日挑取单菌落培养，经PCR鉴定为阳性的重组质粒送至上海华津生物科技有限公司进行测序。同时，以重组质粒pCold-AS87-01740转化BL21感受态细胞，然后涂布于含氨苄的LB琼脂培养基上，37℃过夜培养；次日挑取单菌落接种于含氨苄的LB液体培养基（5mL）中，采用PCR进行筛选鉴定。

1.6重组蛋白原核表达及抗原性分析

按1：100比例将测序验证正确的阳性重组菌株接种到100mL含氨苄的LB液体培养基中，37℃下摇床（200r/min）培养2.0-2.5h，于OD_600nm达0.6-0.8时加入IPTG至终浓度为1mmol/L，18℃下诱导表达24h，收集菌体后采用高压破碎，离心分离上清液和包涵体，以SDS-PAGE检测融合蛋白的表达形式。经His标签蛋白纯化磁珠纯化后的融合蛋白使用Westernblotting进行抗原性分析。

2结果与分析

2.1鸭疫里默氏杆菌AS87-01740基因克隆结果

以鸭疫里默氏杆菌基因组为DNA模板，采用设计的AS87-01740特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，发现约在600bp处出现单一的清晰条带（图1），与预期结果一致。

2.2AS87-01740基因测序及进化树分析结果

测序结果表明，AS87-01740基因编码框全长618bp，编码205个氨基酸，理论分子量约21.87kD，理论等电点（pI）8.2，正电荷氨基酸总数17个，负电荷氨基酸总数16个。利用NCBI数据库进行BLAST比对分析，并以DNASTAR进行多重序列比对分析，结果表明，AS87-01740蛋白属于外膜蛋白家族（OMPs），其氨基酸序列在同种属分离株中，与2型血清型分离株（11845、YM、GD和CH-2）有很高的相似性（>99%），与1型血清型分离株（CH-1和CH-3）的相似性为92%（图2）；在不同种属中，与金黄杆菌（Chryseo-bacteriumsp.）、动物溃疡伯格菌（Bergeyellazoohel-cum）和脑膜炎败血伊丽莎白菌（Elizabethkingiame-ningosepticum）的相似性分别为61%、60%和57%（图3）。基于多重序列比对分析结果构建系统发育进化树，发现金黄杆菌与脑膜炎败血伊丽莎白菌先聚为一支，再与鸭疫里默氏杆菌聚类，而动物溃疡伯格菌菌与以上3种菌株形成较远的分支（图4）。

2.3原核表达载体鉴定结果

PCR鉴定重组质粒pCold-AS87-01740，可扩增获得约600bp的目的片段（图5），与预期结果相符。将PCR鉴定结果呈阳性的克隆株送至上海华津生物科技有限公司进行测序，结果显示获得的pCold-AS87-01740阳性克隆与目的序列的相似性达100%，说明目的片段亚克隆成功。

2.4融合蛋白表达形式检测结果

以测序正确的阳性重组质粒pCold-AS87-01740转化BL21感受态细胞，18℃下1mmol/LIPTG诱导表达24h（180r/min）后，采用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达形式。结果显示，在77kD位置附近出现明显表达的目的蛋白条带（图6），且上清液中的融合蛋白表达量较包涵体中的更多，说明融合蛋白以可溶性表达形式为主。

2.5融合蛋白纯化及其抗原性分析结果

采用His标签蛋白纯化磁珠对融合蛋白上清液进行纯化，得到的纯净目的蛋白大小约77kD（图7），与预期结果相符。Westernblotting检测结果表明，纯化后的融合蛋白能与鸭疫里默氏杆菌阳性血清发生较强的特异性免疫反应（图8），是研发鸭疫里默氏杆菌疫苗的潜在抗原。

3讨论

AS87-01740基因編码蛋白属于外膜蛋白家族（OMPs），OMPs是革兰氏阴性菌细胞外膜的主要结构蛋白，包括OmpA、脂蛋白（Lipoprotein，Lpp）和微孔蛋白（P0rins）等，在细菌外膜维持、黏附、入侵、营养物质运输及功能蛋白合成等方面发挥重要作用（周业菲，2013）。此外，OMPs能在缺乏免疫佐剂辅助的情况下诱导特异性免疫反应，且能辅助其他抗原内化和交叉提呈，具有潜在的免疫载体功能（Lut-wycheeta1.，1995；RahmanandKawai，2000），可同时诱导动物体的体液免疫和细胞免疫，现已广泛应用于疫苗研发领域（Puohiniemieta1.，1990；Jeannineta1.，2000）。因此，鸭疫里默氏杆菌的OmpA作为跨膜蛋白，在维持其外膜结构上具有重要作用（Sonntageta1.，1978；周祖涛等，2008），可作为黏附素或侵袭素，与细菌毒力密切相关。

本研究采用PcR成功克隆获得鸭疫里默氏杆菌的AS87-01740基因，并利用pcold-TF原核表达载体在大肠杆菌BL21感受态细胞中诱导表达出融合蛋白。SDS-PAGE检测结果表明，诱导表达获得的融合蛋白以可溶性的表达形式为主，且能与鸭疫里默氏杆菌阳性血清发生特异性免疫反应，是研发鸭疫里默氏杆菌疫苗的潜在抗原。NCBI数据库BLSAT比对分析结果表明，AS87-01740基因编码蛋白在不同血清型鸭疫里默氏杆菌中具有很高的保守性，可作为鸭疫里默氏杆菌的共有抗原。但系统发育进化树分析结果表明，AS87-01740同源蛋白在金黄杆菌、动物溃疡伯格菌和脑膜炎败血伊丽莎白菌等种属中也有分布，意味着AS87-01740基因编码的同源蛋白可能是一种毒力因子，可在不同细菌种属中扩散。因此，今后需进一步加强对AS87-01740蛋白的研究，以期为研发鸭疫里默氏杆菌新疫苗和新药物提供技术储备。

4结论

AS87-01740基因编码蛋白在不同鸭疫里默氏杆菌分离株中具有很高的保守性，且能与其阳性血清发生特异性免疫反应，是研发鸭疫里默氏杆菌疫苗的潜在抗原。

（责任编辑兰宗宝）