张安世　骆扬　范定臣　张中海

摘要： 采用SCoT标记分析了18个皂荚种质的遗传多样性，并采用UPGMA法对18个皂荚种质进行了聚类分析。在此基础上，通过筛选出的多态性条带构建了18个皂荚种质的SCoT指纹图谱。扩增结果表明：从51个SCoT引物中筛选了15个引物进行PCR扩增，共扩增出226条带，其中多态性条带216条，多态性比率为96.61%。各引物多态性信息含量（PIC）、观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Neis基因多样性指数（H）和Shannons信息指数（I）的平均值分别为0.875 9、1.964 9、1.440 1、0.272 6、0.426 1。18个皂荚种质的遗传相似系数在0.491 4～0.938 1之间，表明供试材料之间具有较丰富的遗传多样性。聚类分析结果表明： 在遗传相似系数为0.60处可将18个皂荚种质分为3组，其中野皂荚单独为一组，山皂荚和皂荚T聚为一组，其它皂荚材料聚为一组。利用3个引物扩增的8个多态性位点构建了18份皂荚种质资源的DNA指纹图谱，可以将其区分并精准鉴定。该研究结果为皂荚种质的鉴定和新品种选育提供了一定的理论依据。

關键词： 皂荚， SCoT， DNA指纹图谱， 遗传多样性

中图分类号： Q949.9， S718.46

文献标识码： A

文章编号： 10003142（2017）11137808

Abstract： Genetic diversity of eighteen Gleditsia sinensis germplasms was analyzed based on SCoT markers， the cluster analysis on eighteen G. sinensis germplasms was carried out by UPGMA method， and the SCoT fingerprints of eighteen G. sinensis germplasms were constructed by the polymorphic bands. The results of amplification showed that， 226 SCoT bands were obtained from fifteen primers selected from 51 SCoT primers， including 216 polymorphic bands， with a polymorphism rate of 96.61%. The average of the polymorphism information content（PIC）， observed number of alleles（Na）， effective number of alleles（Ne）， Neis gene diversity （H） and Shannons information index （I） were 0.875 9， 1.964 9， 1.440 1， 0.272 6 and 0.426 1， respectively. The genetic similarity coefficients of these samples were between 0.491 4 and 0.938 1. Therefore， it indicates that there are rich genetic diversities among these materials. The results of cluster analysis showed that， eighteen G. sinensis germplasms could be divided into three groups when the genetic similarity coefficient was 0.60. G. heterophylla formed the first group， G. melanacantha and ZaojiaT formed the second group， and the others formed the third group. DNA fingerprints of eighteen samples were constructed from eight polymorphic loci amplified by three primers， and these materials could be distinguished and identified accurately. All these results provide the important information for the identification and breeding for new cultivars of G. sinensis.

Key words： Gleditsia sinensis， SCoT， DNA fingerprint， genetic diversity

皂荚属（Gleditsia Linn.） 系豆科苏木亚科， 全世界约12种， 主要分布于亚洲、美洲和热带非洲（顾万春等，2003）。中国产8种， 引进1种， 其中中国皂荚是分布在我国的特有种， 广泛分布于我国东北、华北、华东、华南等地， 多生长于平原、山谷及丘陵地区。皂荚能抗旱、耐盐、耐高温，具有多种多样的生态属性，遗传多样性程度高，是经济林、用材林、防护林及园林绿化的理想树种（顾万春等，2003；杨海东，2003）。皂荚具有很高的药用价值，皂荚、皂刺、皂根、皂叶均可入药，特别是棘刺是中医治疗乳腺癌、肺癌等多种癌症的常用配伍药之一， 被列为抗癌中草药（蒋建新等，2003）。同时，皂荚还是优良的城市抗污染剂和日用化工原料（王蓟花等，2008）， 杀虫、杀鼠效果也非常好（张宏利等，2013）。目前国内外对皂荚的研究主要集中在皂荚果实与皂刺中活性成分（张宏利等，2013； 余俐佳等， 2016）、引种栽培（范定臣等，2015）及生态属性（杨海东，2003）等方面，并开展了相关的遗传学研究（兰彦平和顾万春，2006； 李伟等，2013）。最近，分子标记技术也已开始在皂荚研究中得到应用。邢俊连等（2017）成功地进行了皂荚ESTSSR引物的开发与筛选，且证实这些引物在其近缘种间具有很高的通用性，为以后开展皂荚种质资源的遗传多样性研究提供有效的分析方法和手段。李伟等（2017）利用AFLP分子标记技术对10个南方皂荚群体进行了遗传多样性分析，结果表明群体内的变异是皂荚遗传变异的主体，皂荚群体的遗传多样性与遗传结构的形成不仅与其分布广泛、种子特性及生活史有关，而且与人为的砍伐、引种、生境片段化等因素有重要关系，并由此提出了皂荚的保护策略。就目前而言，分子标记技术在皂荚的系统进化、种质资源鉴定、指纹图谱构建等方面还缺乏有效利用。

随着分子生物学的发展，大量的分子标记技术被开发利用，每种分子标记技术都各有其特点。目标起始密码子多态性（start codon targeted polymorphism， SCoT）是由Collard & Mackill（2009）开发的新目的基因分子标记技术，并首先在水稻上得以应用，是一种基于单引物扩增反应的分子标记技术。SCoT具有操作简单、通用性良好、多态性丰富、成本低廉等优点，同时又能对性状进行跟踪，有利于分子辅助育种，已在多种植物上得到成功应用（杨祥燕等，2013； 王健胜等，2015； 王发明等，2017）。因此，本试验采用SCoT标记对河南省18份皂荚种质资源进行遗传多样性分析，并构建DNA指纹图谱，以期为皂荚种质资源的鉴定和优良品种的选育等研究提供科学依据。

1材料与方法

1.1 材料和试剂

材料包括3个种共18份，具体见表1。除野皂荚、山皂荚和皂荚T为实生苗外，其余的15份材料是以单株产量高、单刺（或单果）平均重量重的皂荚植株为接穗、野皂荚为砧木（济科除外）嫁接而获得的无性系， 其中部分品种已经通过河南省

林木品种审定委员会审定。另外皂荚T是从土耳其引进种子的3年生实生苗，曾被当做皂荚品种，但其所表现出的形态特征与皂荚有较大差异，而与山皂荚极为相似。所有材料均随机选取3株，每株采集2片健康、幼嫩叶片，置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

试剂为2×Taq MasterMix（含有Taq DNA Polymerase， 2×Taq PCR Buffer， 3 mmol·L1 MgCl2和400 μmol·L1 dNTP mix）购自北京康为世纪生物科技有限公司，SCoT引物根据苏亚春等（2012）公布的40条引物序列由金唯智生物科技（北京）有限公司合成。

1.2 皂荚基因组DNA的提取

每个皂荚品种取3片不同植株的幼嫩叶片等量混合，采用改良CTAB法（张安世等，2009）提取皂荚基因组DNA，并将模板DNA浓度稀释至20 ng·μL1，保存于-20 ℃备用。

1.3 SCoTPCR分析

选用40个SCoT单引物（SC1SC40）和11个由SCoT单引物搭配而成的引物组合共计51个引物对供试材料进行扩增。反应体积 10 μL，其中DNA 1.0 μL，引物 1.4 μL，2×Taq MasterMix 5.0 μL，RNaseFree water 2.6 μL。SCoTPCR扩增程序：首先94 ℃预变性5 min；然后进行40个循环，包括94 ℃变性1 min，50 ℃复性1 min，72 ℃延伸1.5 min。最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存备用。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶分离。

1.4 数据统计分析

根据电泳结果进行条带的统计分析。在电泳图相同位置上若出现DNA条带记为“1”， 无记为“0”，形成1，0矩阵，将此矩阵导入POPGENE1.32软件进行多态性百分率（PPL）、观测等位基因数（Na）、

有效等位基因数（Ne）、Neis基因多样性（H）和Shannons信息指数（I） 等遗传多样性参数分析，参照黄秀等（2014）方法计算引物多态性信息含量（PIC），通过NTSYSpc 2.0软件依据UPGMA法进行聚类分析，同时参照云天海等（2013）的方法构建18个皂荚种质DNA指纹图谱。

2结果与分析

2.1 SCoT引物筛选与多态性分析

选用51个SCoT引物对18份皂荚种质材料进行了PCR扩增，最终筛选出了条带清晰、多态性高、重复性好的15个引物，其中，包括10个SCoT单引物和5个引物组合。所用引物序列及多态性统计结果见表2。15个引物共扩增出226个条带，其中多态性条带216个，多态位点百分率（PPL）为96.61%。多态性信息含量（PIC）的变化范围为0.783 0～0.925 6，平均值为0.875 9。说明所选引物在18个皂荚种质间具有很高的SCoT多态性。观测等位基因数（Na）的变化范围为1.812 5～2.000，平均值为1.964 6；有效等位基因数（Ne）的变化范围为1.319 1～1.591 0，平均值为1.440 1；Neis基因多样性指数的变化范围为0.215 4～0.345 0，平均值为0.272 6；Shannons信息指数的变化范围为0.349 0～0.516 8，平均值为0.426 1。上述结果表明，18个皂荚种质间存在较丰富的遗传多样性。同时，利用SPSS17.0软件对4个主要遗传多样性参数多态性信息含量、有效等位基因数、Neis 基因多样性指數和Shannons信息指数进行非参数Kruskal Wallis Test独立样本检验，结果显示18个皂荚种质之间遗传多样性水平存在显著性差异（X2=49.795，P=0.000﹤0.001），表明上述分析得到的各参数值能很好地说明皂荚种质间遗传多样性水平。

2.2 遗传相似性和聚类分析

利用NTSYSpc软件计算种质间的遗传相似系数（Gs），结果表明18份皂荚种质两两间的Gs在0.491 4～0.938 1之间，平均值为0.711 4，变幅为0.446 7，说明供试材料间存在较大的遗传差异。其中焦科4和焦科5的Gs最大（0.938 1），亲缘关系最近，山皂荚和豫皂2的Gs最小（0.491 4），亲缘关系最远。

利用NTSYSpc软件对18份皂荚种质进行聚类分析。结果表明（图2），在Gs为0.60处可将18分皂荚材料分为3组。第1组为野皂荚；第2组为山皂荚和皂荚T；第3组共有15个皂荚种质材料：密刺、硕刺、皂荚H、豫皂1、怀皂王2、博科、焦科1、焦科2、焦科3、济科、嵩刺1、太行2、豫皂2、焦科4和焦科5。

2.3 DNA指纹图谱的构建

通过筛选的15个引物对18份皂荚种质的扩增结果分析，选取其中SC1、SC13和SC23 3个引物扩增的8个多态性位点构建了18份皂荚种质的DNA指纹图谱（图3）。每份材料都有唯一的指纹图谱，可以将18份皂荚种质区分并准确鉴定。

3讨论与结论

3.1 皂荚种质资源的遗传多样性分析

利用分子标记技术分析皂荚种质资源的遗传多样性，了解不同皂荚种质之间的遗传差异，对于皂荚的新品种选育和种质资源鉴定具有重要意义。在遗传多样性研究中，多态性是评价遗传多样性的重要依据之一。在本研究中，通过SCoT标记对18份皂荚种质资源的遗传变异分析表明，多态性位点百分率 （PPL）高达96.61%，多态性信息量（PIC）为0.875 9，处于高水平（高：PIC >

0.5； 适中： 0.5 > PIC > 0.25； 低： PIC < 0.25）（徐玉仙等，2015），说明本研究筛选的引物在供试材料间具有很高的多态性，可以有效的用于皂荚的遗传多样性分析。同样，有效等位基因数、Neis 基因多样性和 Shannons 信息指数分别为1.440 1、0.272 6和0.426 1，也处于较高水平。另外，18个皂荚种质间的遗传相似系数（Gs）在0.491 4～0.938 1之间，变幅达0.446 7，说明供试材料间存在较丰富的多样性。通过对多态性信息量、有效等位基因数、Neis 基因多样性指数和Shannons信息指数，4个主要的遗传多样性参数进行的非参数Kruskal Wallis Test独立样本检验结果也证实了这一结论。

3.2 皂荚种质资源的聚类分析

本研究涉及野皂荚、山皂荚和皂荚共3个种18份材料。聚类结果表明，在Gs为0.60处可将18份皂荚种质分为3组。其中，野皂荚单独为一组，山皂荚和皂荚T聚为一组，其余15份皂荚种质材料聚为一组。在上述第3组的15份皂荚种质中，焦科4和焦科5是以皂荚荚果为目的选育的品种，其余均以皂刺为目的选育。焦科4和焦科5的接穗均为荚果较大的不同皂荚品种，在所有供试材料中亲缘关系最近，在其15份皂荚种质一组聚为一个分支，其它13份材料聚为另一分支，与预期相符。济科是以嵩刺1为接穗、山皂荚为砧木的嫁接品种，两者首先聚在一起，也与实际情况相吻合。从聚类图中还能看出部分种质材料具有一定的地理来源一致性特征。如采集于河南修武的5份材料除焦科4和焦科5聚在一起外，焦科1、焦科2和焦科3也聚在一起；采集于河南博爱的5份材料也分别聚于2个分支，豫皂1、怀皂王2和博科为一个分支，太行2和豫皂2为另一分支；采集于河南嵩县的3份材料除嵩刺1外，其余2份材料密刺和硕刺聚在一起。另外，皂荚T是从土耳其引进种子的三年生播种苗，起初曾被作为皂荚品种，但其三年生播种苗无论从叶的形态、皮孔大小及形状以及嫩枝的颜色都与山皂荚极为相似，因此认为该种子在引进时可能鉴定有误。本研究结果显示山皂荚和皂荚T聚为一组，两者具有很近的亲缘关系，因此，应将皂荚T归为山皂荚而非皂荚品种，同时还要结合其它标记技术及其以后的生长过程中所表现出的其它形态学特征进行进一步的验证。

3.3 皂荚种质资源鉴定与DNA指纹图谱构建

分子标记是以DNA多态性为基础的遗传标记，能直接反映植物间的遗传差异，具有高效、快捷、准确度高、信息量大等优点，已经成为植物种质鉴定的有效方法，也是数字化身份证构建的有效工具，已在大量的种质资源研究中得到应用。SCoT作为一种新型的DNA分子标记技术，在植物种质鉴定和DNA指纹图谱构建方面已经得到了初步应用。陈红等（2014）利用SCoT分子标记技术对71份贵州桃种质进行了分析，结果表明，来自贵阳和黔南州荔波县的两份青桃资源（20号和39号）亲缘关系较远，说明它们为同名异物。同时也证实自同一县份的血桃（31号和32号）和白花桃（16号和19号）不完全是同一样品，从而在分子水平理清了供试材料的亲缘关系，并对部分桃资源名称混乱的现象进行了纠正，为贵州桃种质资源的科学保存与利用提供了依据。林清等（2013）通过对5个SCoT引物在46份供试芥菜种质中扩增所得的16个多态性DNA谱带进行统计，初步构建了芥菜种质的指纹图谱，能够准确地鉴定这46份芥菜种质。本研究利用SCoT技术，选用3个引物扩增的8个多态性位点构建了18份皂荚种质的DNA指纹图谱，为皂荚种质间的鉴别提供了重要的科学依据。

综上所述，通过SCoT标记对18份皂荚种质资源的遗传变异分析表明，18份皂荚种质材料间具有较丰富遗传多样性；聚类分析与皂荚的传统分类基本吻合，并对可疑材料皂荚T进行了合理归类；利用3个SCoT引物扩增的8个多态性位点构建的DNA指纹图谱具有唯一性，可以利用此图谱对供试材料进行鉴定。

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