丁泽红　铁韦韦　付莉莉　颜彦　胡伟

摘要：[目的]克隆木薯海藻糖合成酶基因MeTPS6，并分析其在干旱、低温、遮蔭等非生物胁迫应答中的表达情况，为研究TPS因功能及抗逆分子机理提供参考。[方法]采用RT-PCR从木薯中克隆MeTPS6基因，并进行生物信息学分析及构建系统发育进化树。采用荧光定量PCR（qPCR）分析MeTPS6基因在干旱、低温和遮荫胁迫下不同木薯品种不同组织中的表达特性及模式。[结果]克隆获得的MeTPS6基因具有一个2565 bp的开放阅读框，编码854个氨基酸，含有TPS家族保守结构域（Glyco_transf_20）。MeTPS6蛋白与杨树（Potri.010G104500）和杞柳（SapurV1A.0015s0610）同源蛋白氨基酸序列的相似性分别达92.6%和90.0%，表明木薯与杨树和杞柳的亲缘关系较近。MeTPS6～因的启动子序列中存在大量非生物胁迫相关元件（低温相关元件LTR、干旱相关元件MBS等）、激素相关元件（脱落酸相关的元件ABRE～ICE3、水杨酸相关元件TCA-element～）及光响应相关元件（ACE、Box I等）。MeTPS6基因在木薯储藏根中的表达量最高，须根次之，二者均显著高于茎、叶柄和叶片中的表达量（P<0.05，下同），且在干旱、低温和遮荫胁迫下，不同组织中的表达模式存在明显差异。对于不同木薯品种，干旱、低温和遮荫胁迫处理均显著诱导其MeTPS6基因表达。在高置信度（confidence=0.8）的情况下，共找到13个共表达基因，其中有10个为TPS同源基因，表明这些同源基因可能相互协调，共同参与植物生物学过程；另外3个基因（CAT、CAT1和F5M15.5）均编码过氧化氢酶，主要参与保护细胞免受过氧化氢的毒性作用。[结论]MeTPS6基因主要在木薯的根（特别是储藏根）中表达，并从转录水平参与干旱、低温和遮荫胁迫响应，可作为候选基因进一步研究其在木薯抗逆中的功能。

关键词：木薯；海藻糖合成酶；MeTPS6基因；干旱；低温；遮荫；表达分析

中图分类号：S533.034 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）11-1923-07

0引言

[研究意义]木薯（Manihot esculenta Crantz）属于大戟科木薯属块根植物，其块根富含淀粉，是热带、亚热带地区重要的经济作物和粮食作物。木薯作为典型的热带作物，适应性强，耐旱耐瘠，但在低温、长时间干旱或严重干旱条件下，其块根产量大幅度减产甚至绝收（卢赛清等，2009；Okogbenin et a1.，2013）。此外，块根产量还受遮荫、耕作方式等因素的影响，如拉丁美洲等经济落后地区将木薯与其他作物（橡胶树、玉米等）问作使其受到不同程度的遮荫胁迫，其产量显著减少（Okoli and Wilson，1986；Fu et a1.，2016）。海藻糖-6-磷酸合成酶（Trehalose-6-phosphate synthase，TPS）是海藻糖生物合成代谢的关键酶，在植物干旱、低温等逆境胁迫中发挥重要作用（Li et a1.，2011；Yang et a1.，2012；Mu et a1.，2016）。因此，克隆木薯TPS相关基因并进行表达分析对深入研究其在木薯抗胁迫中的表达调控作用具有重要意义。[前人研究进展]海藻糖是由2个葡萄糖分子通过α-1，1糖苷键连接而成的非还原性双糖，植物在干旱、低温、氧化等胁迫下其大量积累，可保护蛋白质、核酸、生物膜等生物大分子物质，以增强植物的抗逆性（Garg et a1.，2002；郭蓓等，2008）。海藻糖合成包括两步反应：一是由尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖在TPS的催化下生成6-磷酸海藻糖；二是6-磷酸海藻糖在海藻糖6-磷酸酯酶的水解作用下生成海藻糖（史健志等，2015）。可见，TPS是海藻糖生物合成途径中的一个关键酶。经研究证实，植物体内TPS基因表达与海藻糖含量密切相关（Garg eta1.，2002；Li et a1.，2011）。目前，已从棉花（Kosmaset a1.，2006）、水稻（Li et a1.，2011）、茶树（丁菲等，2012）、拟南芥（Delorge et a1.，2014）、坛紫菜（史健志等，2015）、碱茅（李莹和柳参奎，2015）、辣椒（魏兵强等，2016）、香蕉（王安邦等，2016；邢文婷等，2017）等植物中克隆获得TPS基因，并对其功能进行深入研究，结果表明非生物胁迫可诱导TPS基因表达，植物体内海藻糖含量明显升高。郭蓓等（2008）研究发现，将拟南芥TPS基因转入烟草后，转基因烟草植株体内海藻糖含量明显增加，其耐受盐胁迫的能力显著增强。Garg等（2002）、Li等（2011）研究发现，在干旱、低温和高盐条件下，转OsTPS1基因水稻植株抗性均明显增强，其植株体内海藻糖含量是野生型的2倍。Kosmas等（2006）、Deng等（2014）研究表明，在干旱胁迫下，棉花GkTPS基因和海带SiTPS基因的表达量显著升高。丁菲等（2012）、魏兵强等（2016）研究表明，在低温胁迫下，辣椒CaTPS基因和茶树GsTPS基因的表达量均显著升高。史健志等（2015）研究表明，在高温和干旱胁迫下，坛紫菜PhTPS基因的表达显著上调。Henry等（2014）研究表明，在遮荫胁迫下，玉米TPS因的表达量发生显著变化。此外，TPS因的表达量在同一植物不同组织中呈差异性表达（丁菲等，2012；魏兵强等，2016）。综上所述，植物体内TPS基因受干旱、低温、遮荫等胁迫诱导表达，通过提高其表达量可增强植株的抗逆性。[本研究切入点]目前尚未见有关木薯TPS因克隆及其在非生物胁迫下表达分析的研究报道。[拟解决的关键问题]克隆木薯TPS基因（MeTPS6），并采用荧光定量PCR（qPCR）检测其在不同品种、同一品种不同组织及在干旱、低温和遮荫等胁迫下的表达特性，为研究MeTPS6基因功能及抗逆分子机理提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料为木薯栽培品种Arg7和Ku50及野生种W14（M.esculenta ssp.Flabellifolia），来自中国热带农业科学院热带生物技术研究所试验基地。Arg7和Ku50是w14经人工选择与驯化获得，其适应性和部分农艺性状均优于W14，如Ku50的块根产量和淀粉含量较高，抗逆性较好；Arg7适宜于高纬度地区生长，但抗旱性一般。主要试剂：RNA抽提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司]；cDNA反转录试剂盒购自Fermentas公司；SYBR Premix Ex Taq（SYBR Green I）试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。主要仪器设备：Mx 3005P荧光定量PCR仪（Stratagene，美国）。

1.2种植与胁迫处理

参照Ding等（2016）的方法种植木薯：将Ku50种茎切成10-15cm茎段，选择粗细均匀且具有2～4个芽眼的茎段扦插于塑料盆（上直径18.5cm，下直径14.8cm，高18.5cm）中，每盆扦插1个茎段。木薯盆栽基质是由蛭石与营养土按照1：1（v/v）混合而成。种植10d后进行间苗，每盆保留1棵苗，用于胁迫处理。干旱胁迫处理：木薯种植60d后，挑选生长状况基本一致的植株，施用20%PEG-6000溶液进行模拟干旱胁迫处理，以不施PEG-6000（浇自来水）的植株-为对照。于胁迫0、3和24h后分别采集未展开叶、第一片完全展开叶、老叶和根，液氮速冻后，于80℃保存备用；低温胁迫处理：木薯种植60d后，挑选长势基本一致的植株置于光照培养箱，于4℃条件下进行低温胁迫处理。于胁迫0、6和24h后分别采集未展开叶、第一片完全展开叶和根，液氮速冻后，于-80℃保存备用；遮荫胁迫处理：将木薯种植于橡胶树下进行遮荫胁迫处理，以正常光照下种植的木薯为对照。种植60d后挑选长势基本一致的植株，采集其未展开叶、第一片完全展开叶和老叶，液氮速冻后，于80℃保存备用。

2015年夏季将W14、Ku50和Arg7的种茎（10～15cmK，含2～4个芽眼）分别种植于中國热带农业科学院文昌试验基地，株行距0.8m×1.0m，各30株，水肥管理与大田种植相同。种植90d后分别采集W14、Ku50和Arg7的叶片和根，用于qPCR检测不同木薯品种不同组织中MeTPS6基因的表达情况；采集Ku50的叶片、叶柄、茎、须根和储藏根，用于qPCR检测同一品种不同组织中MeTPS6基因的表达情况。

1.3RNA提取及cDNA合成

参照RNA抽提试剂盒说明提取样品总RNA，并使用cDNA反转录试剂盒反转录成cDNA，于-20℃保存备用。

1.4引物设计及合成

根据Phytozome木薯数据库提供的TPS基因序列（cassava4.1001584m），采用Primer6.0设计引物，包括MeTPS6基因全长扩增引物（MeTPS6-F：5'-ATGGTGTCAAGGTCATACTCA-3'；MeTPS6-R：5'-TTACACTGCAACTGTTTGTTCT-3'）、MeTP$6基因qPCR引物（qMeTPS6-F：5'-TCTGGGGAGTCTCCATCGTT-Y：qMeTPS6-R：5-TGCCCTTATTGGCAGCTGA-3）和actin基因qPCR引物（qActin-F：5'-TGATGAGTCTGGTCCATCCA-3'；qActin-R：5'-CCTCCTACGACCCAATCTCA-3'）（Fu et a1.，2016）。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5基因克隆

以木薯叶片cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系50.0μL：cDNA模板1.0μL，2.5mmol/L dNTPs4.0μL，10xLA Buffer 5.0μL，5 U/μL LA Taq DNA聚合酶0.5μL，10μmol/L正、反向引物各1.0μL，ddH20补充至50.0μL。扩增程序：94℃预变性5.0min；94℃45s，50℃45s，72℃3.5min，进行35个循环；72℃延伸7.0min；25℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.6qPCR检测

利用SYBR Premix EX Taq试剂盒在Mx 3005P荧光定量PCR仪上进行qPCR检测。反应体系20.0μL：SYBR Green I 10.0μL，ROX 0.4μL，正、反向引物各0.4μL，cDNA模板2.0μL，ddH20补充至20.0μL。扩增程序：95℃预变性30s；95℃10s，55℃10s，72℃20s，进行40个循环。每个样品重复3次，采用2法计算基因相对表达量（Fu et a1.，2016）。

1.7生物信息学分析

在Phytozome数据库中利用BLASTp在线搜索MeTPS6基因的同源序列，利用ClustalX进行序列比对（Jeanmougin et a1.，1998），利用MEGA 5.2构建系统发育进化树（Tamura et a1.，2011），利用ExPASyProtParam分析蛋白质的理化性质，利用Plant-mPLoc进行亚细胞定位预测，利用NCBI-CDD数据库分析蛋白质的保守结构域，利用PlantCARE分析启动子元件，利用STRING数据库构建基因共表达调控网络。

1.8统计分析

采用Excel 2007进行统计和制图，并以Duncan s进行差异显著性分析。

2结果与分析

2.1MerPS6基因克隆及序列分析结果

MeTPS6基因PCR扩增结果显示，扩增条带单一且清晰，长度约2500bp，与预期结果相符（图1）。测序结果显示，该序列长度为2565bp，编码854个氨基酸。经BLASTx比对分析，发现MeTPS6基因与拟南芥TPS基因的同源性最高（83.3%）。将MeTP$6基因序列提交至GenBank，登录号为MF684374。MeTP$6基因与参考序列（cassava4.1 001 584m）的比对分析结果显示，二者存在7个碱基差异，但均为同义突变。MeTPS6基因与基因组DNA序列的比对分析结果显示，该基因含3个外显子和2个内含子。生物信息学分析结果显示，MeTPS6基因编码蛋白（MeTPS6）分子量为96860-4 Da，理论等电点（pI）为5.83，属于不稳定蛋白，不稳定系数为45.76，定位于叶绿体，含有TPS家族保守结构域（GlyCO transf_20）（图2）。

2.2系统发育进化树分析结果

经BLASTp同源序列比对，获得与MeTPS6蛋白氨基酸序列同源性较高的其他物种蛋白氨基酸序列，并构建系统发育进化树（图3）。结果显示，这些同源蛋白可分为四大类：第1类包括水稻、高粱、狗尾草、柳枝稷、谷子和玉米，除水稻外均为C4物种，且水稻与柳枝稷亲缘关系最近；第Ⅱ类包括琴叶拟南芥、鼠耳芥、拟南芥、荠菜花和白菜型油菜，均为十字花科的物种；第Ⅲ类包括木薯、杨树和杞柳，木薯MeTPS6蛋白分别与杨树（Potri.010G104500）和杞柳（SapurVlA.0015s0610）同源蛋白的氨基酸序列相似性分别达92.6%和90.0%，表明木薯与杨树和杞柳的亲缘关系最近；第Ⅳ类仅包括二穗短柄草，虽然二穗短柄草然也为C4物种，但其序列与其他C4物种存在明显差异，故单独聚为一类。

2.3MeTPS6基因启动子元件分析结果

启动子是基因的重要组成部分，调控着基因转录的起始时间和表达水平。本研究选取MeTPS6基因起始密码子上游1500bp进行启动子元件分析，结果发现该基因的启动子序列中不仅存在大量非生物胁迫相关的元件，如低温相关元件LTR、干旱相關元件MBs等，还存在许多激素相关的元件，如脱落酸相关的元件ABRE和CE3、水杨酸相关元件TCA-ele-ment、生长素相关元件TGA-element、茉莉酸相关元件TGACG-motif，赤霉素相关元件GARE-motif及光响应相关元件ACE、Box I、Box II和G-Box等。其中，脱落酸是一种重要的激素，在植物低温、干旱、高盐等非生物胁迫中发挥非常关键的调控作用。表明MeTPS6基因可能从转录水平参与干旱、低温和光照（遮荫）胁迫响应。

2.4MeTPS6基因在不同品种不同组织中的表达特性分析结果

MeTPS6基因在w14、Ku50和Arg7叶片和根中的表达情况如图4所示。在叶片中，MeTPS6基因在W14的表达量最高，Ku50次之，Arg7最低，均达显著差异（P<0.05，下同）；在根中，MeTPS6～因在Ku50的表达量显著高于W14和Arg7，而w14和Arg7的差异不显著（P>0.05，下同）。对7：Ku50和Arg7，MeTPS6基因在根中的表达量均显著高于叶片，但对于W14，MeTPS6基因在根和叶片中的表达量无显著差异，故推测木薯从野生种到栽培种的驯化过程中MeTPS6基因受到了人为选择，使得MeTPS6基因主要在木薯栽培种的根中起调控作用。MeTPS6基因在Ku50不同组织中的表达特性如图5所示。MeTPS6基因的表达量在储藏根中最高，须根次之，二者均显著高于茎、叶柄和叶片。

2.5MeTPS6基因在不同胁迫处理下的表达模式分析结果

干旱胁迫下，MeTPS6基因在Ku50不同组织中的表达模式如图6-A所示。随干旱胁迫时间的延长，MeTPS6基因的表达量在未展开叶显著下调，在胁迫3和24h后表达量分别下降17%和24%；MeTPS6基因的表达量在第一片完全展开叶和老叶中均无显著变化；MeTPS6基因的表达量在根中显著上调，在胁迫3和24垢的表达量分别是对照（胁迫0h）的3.0和2.7倍。

低温胁迫下，MeTPS6基因在Ku50不同组织中的表达模式如图6-B所示。MeTPS6基因的表达模式在不同组织中存在明显差异，随低温胁迫时间的延长，在未展开叶中MeTPS6基因的表达量先显著上升后显著下降；在第一片完全展开叶中MeTPS6基因的表达量先无显著变化后显著下降；在根中MeTPS6基因的表达量先显著上升后无显著变化。

遮荫胁迫下，MeTPS6基因在Ku50不同组织中的表达如图6-C所示。MeTPS6基因的表达量在未展开叶、第一片完全展开叶和老叶中均显著上调，胁迫后MeTPS6基因的表达量分别是对照的1.2、1.5和1.3倍。

综上所述，干旱、低温和遮荫胁迫可显著诱导MeTPS6基因表达，且在干旱和低温胁迫下，MeTPS6基因在不同组织中的表达模式存在明显差异，推测在不同组织中MeTPS6基因抗逆境胁迫的调控功能不同。

2.6MeTPS6基因共表达调控网络分析结果

为初步了解MeTPS6基因参与的基因调控网络，利用STRING数据库将MeTPS6基因映射到拟南芥同源序列（AtTPS6）进行共表达分析，结果如图7所示。在高置信度（Confidence=0.8）的情况下，共找到13个共表达基因，其中有10个为TPS同源基因，表明这些同源基因可能相互协调，共同参与植物生物学过程；另外3个基因（CAT、CAT1和F5M15.5）均编码过氧化氢酶，主要参与保护细胞免受过氧化氢的毒性作用。推测TPS基因与CAT基因在胁迫条件下共同发挥氧化还原作用，以保护植物细胞免受伤害，从而增强植物的抗逆性。

3讨论

TPS是海藻糖生物合成途径中的关键酶，在植物干旱、低温、高盐等逆境胁迫下发挥重要作用。植物中TPS基因以基因家族的形式存在，大部分TPS蛋白含有TPS基因家族保守结构域（Henry et a1.，2014）。目前，已从拟南芥、水稻、香蕉、辣椒等多个物种中克隆获得TPS基因，并对其功能进行深入研究（Li et a1.，2011；魏兵强等，2016；邢文婷等，2017），但在木薯中尚无相关报道。本研究从木薯叶片克隆获得MeTPS6基因，其编码854个氨基酸，含有TPS家族保守结构域，与杨树和杞柳TPS基因的亲缘关系较近。

TPS基因在植物不同组织中的表达量存在明显差异（丁菲等，2012；魏兵强等，2016），故推测TPS基因在植物不同组织中发挥不同的调控功能，如辣椒CaTPS基因在叶片中的表达量是根和茎中的5.0～6.0倍（魏兵强等，2016）；香蕉MaTPS基因在球茎、假茎和叶中表达量较高，在果实中较低（王安邦等，2016）；茶树CsTPS基因在花中表达量最高，根次之，最低是茎、芽、叶和种子，表达丰度仅为花的13%～41%（丁菲等，2012），因此，TPS；～因表达呈明显的组织特异性。本研究也发现，MeTPS6基因在储藏根中的表达量最高，在茎、叶柄和叶片中的表达量最低，表明MeTPS6基因主要在木薯的储藏根中发挥抗胁迫调控作用。

启动子是基因表达调控的重要元件。本研究通过对MeTPS6基因的启动子序列进行分析，结果发现启动子序列存在大量非生物胁迫相关元件、激素相关元件及光响应相关元件，由此推测MeTPS6基因参与低温、干旱和光照（遮荫）胁迫下抗胁迫相关的调控。因此，本研究分别对木薯进行干旱、低温和遮荫胁迫，并比较分析木薯不同组织中MeTPS6基因的表达情况，结果表明，MeTPS6基因表达受干旱、低温和遮荫胁迫诱导，其原因可能是在干旱、低温等胁迫条件下，植物体内会迅速积累各种小分子化合物（海藻糖、脯氨酸等）以保持细胞的水含量，同时细胞中抵抗氧化损伤的关键酶包括超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶会被激活（Fu et a1.，2016），故相关基因表达上调。本研究还发现多个TPS同源基因（包括METPS6）和CA瑾因共表达，间接验证了上述推论。脱落酸是植物响应干旱、低温等非生物胁迫的一种重要的植物激素（Shinozaki，2007）。虽然本研究在MeTPS6基因的启动子区域发现脱落酸相关元件（ABRE），但MeTPS6基因是否通过脱落酸途径参与木薯抗干旱、低温等非生物胁迫，及CAT基因是否也参与相关基因调控网络尚不清楚，均有待深入研究。

4结论

MeTPS6基因主要在木薯的根（特别是储藏根）中表达，并从转录水平参与干旱、低温和遮荫胁迫响应，可作为候选基因进一步研究其在木薯抗逆中的功能。

（责任编辑陈燕）