史庆玲 徐立新 闫瑾 肖琳琳

摘要[目的]采用TaqMan定量PCR技术检测水稻中外源基因含量。[方法]采用TaqMan定量PCR技术以编码磷脂酶D基因PLD為内标准基因，检测转基因水稻中外源TT51-1的含量。利用DNA梯度稀释法分别求内标准基因PLD和TT51-1的Ct值与拷贝数对数值的标准曲线方程，并将得到的Ct值代入标准曲线方程求取样品中外源基因的拷贝数。[结果]内标准基因PLD标准曲线方程为y=-3.403x+39.939，R2=0.993；TT51-1基因标准曲线方程为y=-3.35x+37.37，R2=0.991，转基因含量为1.21%，不确定度为0.45。[结论]TaqMan定量PCR技术可以用于确定转基因作物外源基因含量。

关键词TaqMan定量PCR；转基因；水稻；拷贝数

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2017）23-0123-02

Detection of Foreign Gene Content in Transgenic Rice by TaqMan Quantitative PCR

SHI Qingling，XU Lixin，YAN Jin et al

（Seed Administrative Station of Henan， Zhengzhou，Henan 450046）

Abstract[Objective] Foreign gene content in transgenic rice was detected by TaqMan quantitative PCR.[Method]Taqman quantitative PCR technique was adopted to detect exogenous TT511 gene content in transgenic rice with PLD as endogenous reference gene. The method of gradient dilution was used to separately calculate Ct value of endogenous reference gene and relevance standard curve equation of logarithm of copies，and then to calculate the copies of samples through substituting thusobtained Ct into standard curve equation.[Result]The standard curve equation of endogenous reference gene was y = -3.403x + 39.939，R2=0.993； the standard curve equation of TT511 gene was y = -3.35x + 37.37，R2=0.991. The content of transgene was 1.21%，the uncertainty was 0.45. [Conclusion]TaqMan quantitative PCR technology can be used to determine the foreign gene content of transgenic crops.

Key wordsTaqMan quantitative PCR；Transgene；Rice；Copies

作者简介史庆玲（1983—），女，山西太谷人，农艺师，博士，从事分子生物学研究。

收稿日期2017-05-10

随着转基因技术的不断发展，水稻作为世界上主要的、消费量最大的谷类作物，已成为植物基因工程研究的主要对象，建立一个精确有效的水稻转基因定量检测体系，对转基因水稻进行监管很有必要，这是一项艰巨长远的任务[1]。依据欧盟转基因食品标簽法规，植物转基因产品检测分为3个步骤：筛选、鉴定和定量[2]。筛选是为了确定植物产品中是否有转基因成分；鉴定是确定转入外源基因的类型；定量是确定转基因的含量。对于我国转基因监管工作人员来说，他们不仅要知道农作物是否为转基因品种，转了何种类型的基因，还要知道有多少外源基因。TaqMan实时定量PCR能够精确地确定样品转基因成分含量，是目前有效的转基因产品定量检测方法[3]。

1材料与方法

1.1材料

转基因水稻样品是由农业部科技发展中心提供的能力验证样品，分别是转基因成分含量为100%的标准样品与待测样品。

TaqMan荧光定量反应试剂盒为Promega mix，实时荧光PCR的引物和探针由上海Invitrogen有限公司合成，引物和探针序列见表1。所用定量PCR仪为Bio-Red IQ5 。

1.2基因组DNA提取

标准样品和待测样品DNA利用康为世纪的DNA提取试剂盒来提取。标准样品DNA溶液经NanoDrop1000测定后，用0.1×TE梯度稀释。

1.3转基因标样中内标准基因和外源基因标准曲线的生成

外源基因TT51-1与内标准基因PLD引物和探针的合成依据农业部2122号公告-8-2014。将标准样品DNA用01×TE依次稀释为100、10、1、0.1、0.01 ng/μL 5个梯度，每个浓度3次重复。外源基因TT51-1的PCR反应体系为25 μL，12.5 μL 2×TaqMan Mix，DNA模板2.0 μL，10 μmol/L的引物F、R及探针分别加2.0、2.0、1.0 μL，无菌水补齐总体积。内标准基因PLD的PCR反应体系为25 μL，12.5 μL 2×TaqMan Mix，DNA模板2.0 μL，10 μmol/L的引物FR及探针各加0.5 μL，无菌水补齐总体积。实时荧光PCR反应程序为95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s，循环数45；在第二阶段的退火延伸时段收集荧光信号。利用Bio-Red IQ5软件生成内标准基因和外源基因的标准曲线。

1.4试样中TT51-1转化体含量的计算

采用相对定量的方法计算转基因的拷贝数，首先分别根据构建的轉基因和内标准基因的定量标准曲线计算出待测样品中转基因和内标准基因的拷贝数，即根据每一个待测样定量PCR检测的Ct值和构建的标准曲线计算各自的拷贝数（表2）。计算拷贝数的公式如下：N=10（y-b）/a，其中N为拷贝数；a为标准曲线的斜率；b为标准曲线的截距；y为待测样的Ct值。

通过公式C=NTT51-1/NPLD×100%，即可算出待测样品中转化体的含量，其中NTT51-1为TT51-1转化体的含量；NPLD为内标准基因PLD的拷贝数。通过公式计算扩展不确定度U=2×0.048 12+（0.182 9×C）2。

2结果与分析

2.1试样中外源基因及内标准基因拷贝数

转基因和内标准基因的定量PCR标准曲线的建立是用定量PCR的方法分析转基因植株中外源基因拷贝数的关键步骤[4]。在应用标准曲线计算外源基因或内标准基因的拷贝数前，首先要确定建立的定量标准曲线可靠、合理。根据实时PCR反应的动力学模型可知，PCR的扩增效率E一般在0～1.0，但是普遍认为最佳的标准曲线的PCR扩增效率为0.9～1.1[5-6]。由图1、2可知，内标准基因PLD的扩增效率为96.7%，TT51-1的扩增效率为98.9%，均满足定量PCR的要求。内标准基因的标准曲线中R2为0.993，TT51-1的标准曲线中R2为0.991，因此建立的标准曲线适合用于转基因拷贝数的分析。

2.2待测样中TT51-1转化体含量及定量结果不确定度

利用标准样品建立的标准曲线及待测样品的Ct值，计算出待测样品中内标准基因及转化体TT51-1的拷贝数。结果表明，3次重复试验内标准基因PLD的拷贝数平均值为64390，转化体TT51-1的拷贝数平均值为53 316.74。由此可知，转化体TT51-1的含量为643.90/53 316.74×100%=121%。将计算结果代入不确定度的计算公式中，得到U为045。

3讨论与结论

我国很早就关注转基因作物的安全问题，早在1993年12月，国家科学技术委员会就颁布了《基因工程安全管理办法》。鉴于转基因作物安全问题的重要性，转基因作物检测人员需要掌握准确高效的检测方法。传统的Southern Blot方法，虽然有准确度高的特点，但存在费时费力的缺点，而且Southern Blot方法要利用同位素，对实验人员和实验室要求较高。TaqMan荧光定量PCR具有很高的灵敏度和非常好的动力学检测范围，特异性的PCR反复进行扩增，仪器收集荧光信号，保证了荧光信号强度与探针和特异性片段的结合数呈正相关，这样循环阈值就与PCR体系中起始DNA量的对数值之间有了严格的线性关系，因此根据样品的循环阈值参照标准曲线，可准确计算出标本内核酸的起始浓度。采用基于实时荧光定量PCR技术绝对定量的标准曲线法对转基因作物外源基因拷贝数进行检测，是确定转基因作物外源基因含量的重要技术。

该研究通过建立水稻标准样品的标准曲线，选择合适的斜率及相关系数并优化TaqMan实时荧光定量PCR体系，对转基因水稻中外源TT51-1含量进行检测，结果表明TaqMan定量PCR技术可以用于确定转基因作物外源基因含量。虽然TaqMan定量PCR技术是一种简便、准确的转基因作物拷贝数的计算方法，但是鉴于PCR技术的灵敏性，该方法需要合适的引物、探针。因此，在鉴定不同作物基因拷贝数的时候需要对反应体系进行优化，并选择合适的引物与探针。

参考文献

[1] 中华人民共和国农业部.农业部关于进一步加强转基因作物监管工作的通知：农科教发[2016]3号[A/OL].（2016-04-17）[2017-04-03].http：//news.163.com/16/0417/22/BKSTHOQJ00014JB5.html.

[2] POPPING B.Methods for the detection of genetically modified organisms：Precision，pitfalls，and proficiency[J].American laboratory，2001，33（3）：70-80.

[3] WURZ A，BLUTH A，ZELTZ P，et al.Quantitative analysis of genetically modified organisms（GMO）in processed food by PCRbased methods[J].Food control，1999，10（6）：385-389.

[4] 王渭霞，賴凤香，洪利英，等.实时定量PCR检测转基因水稻科丰6号插入拷贝数和转基因含量[J].农业生物技术学报，2012，20（1）：9-15.

[5] BAR T，STAHLBERG A，MUSZTA A，et al.Kinetic outlier detection（KOD）in realtime PCR[J].Nucleic，acids research，2003，31（17）：105.

[6] HILL M，MELANSON D，WRIGHT M.Identification of the aph IV gene from protoplastderived maize plants by a simple nonradioactive DNA hybridization method[J].In vitro cellular & developmental biology，1999，35（2）：154-155.

安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（23）：125-127