楚德军 刘建平

摘要：在体外培养的过程中，细胞系是影响球虫发育的主要因素。本研究主要对比不同细胞系对于毒害艾美耳球虫发育的影响。5种不同的细胞系在37℃，5% CO2在6孔板中培养至细胞融合。将纯化好的子孢子在分别37℃和 41℃入侵细胞。利用HE 染色地方法检测细胞内毒害艾美耳球虫的发育程度。所有的细胞系均有球虫入侵。VERO细胞中，毒害艾美耳球虫的发育最好。在VERO细胞培养基中加入不同浓度血清和叶酸，观察球虫发育情况，确定最佳实验条件，为下一步研究做好准备。

关键词：毒害艾美耳球虫；细胞培养；VERO细胞

中图分类号：S858.3 文献标识码：B 文章编号：2096-3637（2017）04-0001-03

1 概述

毒害艾美耳球虫是一种危害养鸡业的重要胞内寄生虫，在研究球虫分子生物学、免疫学、生物化学、细胞培养学和抗药性研究中，体外细胞培养显然起到至关重要的作用。在体外培养过程中，对球虫的生长的影响较大的因素包括细胞系的选择、环境温度以及培养基。本试验通过对比不同细胞系的子孢子入侵时间

2 方法

2.1 子孢子纯化

2.1.1 卵囊破壁

卵囊计数后，3000 r/min，离心10 min弃上清，将沉淀加到组织研磨器中并在冰水中研磨。不断在显微镜下观察，直至90%左右的球蟲卵囊破壁即可，3000 r/min，离心10 min弃去上清。

2.1.2子孢子脱囊

將含有孢子囊的溶液分别加入到A，B，C，D 4种不同配方的脱囊液中，40 ℃水浴，边消化边镜检，在显微镜下，不断观察脱囊情况，30 min后停止消化。

2.1.3子孢子的纯化

配制 20%，30%，65%，70%，75%，80%的蔗糖溶液。先将65%，70%，75%，80%的蔗糖分别加到不同离心管中，再用滴管分别将20%，30%蔗糖溶液依次加到离心管中，并做好标记。并将含有子孢子的脱囊液滴入，1 500 r/min，离心10 min，吸取2种浓度溶液间的白色条带。加入PBS液3 000 r/min离心15 min洗涤蔗糖溶液，计算回收率（纯化后子孢子数/脱囊后计数）。

2.1.4子孢子活性检测

用不同的脱囊液脱囊的子孢子经过同样的方法纯化后，将纯化好的子孢子用PBS定容到2 mL，吸取一滴子孢子液滴在载玻片上再加入两滴伊红Y染液。2 min后在显微镜下观察。计算子孢子的存活率（染色后未见伊红颜色子孢子数/总子孢子数）。

2.2 鸡胚成纤维细胞的制备

A 取9～11日龄鸡胚，取出胚体置于灭菌平皿中，去掉内脏、头、四肢，PBS洗2次。

B 将胚体转移至小烧杯中，充分剪碎，PBS洗2次，吸弃PBS。

C 加入2mL0.25%胰蛋白酶，37℃消化15min左右。

D 轻轻吸弃胰酶，PBS洗2次，吸弃PBS。

E 加少量生长液轻轻吹打，将上清细胞筛过滤；再用生长液将剩余组织块吹开，过滤。

F 过滤后的细胞悬液稀释10倍，进行计数，调整细胞密度为40～60万/mL。

G 加入50mL细胞培养瓶中培养。

H 37℃培养，24～28h形成致密单层。

2.3 鸡肾原代细胞培养

A 取9～11日龄鸡，无菌环境中取肾。

B 将肾转移至小烧杯中，充分剪碎，PBS洗2次，吸弃PBS。

C 加入5倍体积0.25%胰蛋白酶，37℃消化30min左右。

D 轻轻吸弃胰酶，PBS洗2次，吸弃PBS。

E 加少量生长液轻轻吹打，将上清细胞筛过滤；再用生长液将剩余组织块吹开，过滤。

F 过滤后的细胞悬液稀释10倍，进行计数，调整细胞密度为40～60万/mL。

G 加入50mL细胞培养瓶中培养。

H 37℃培养，24～28h形成致密单层。

2.4 传代细胞系细胞代培养

2.4.1冻存细胞复苏：液氮中冻存的MDBK细胞在37℃水浴中迅速溶解（1min之内）。加入细胞瓶中，再加入含有血清、双抗的培养基，37℃，5%CO2培养12h后，倒掉培养基，换入新的含有双抗、血清的培养基。

2.4.2细胞传代：待细胞瓶底的细胞铺满80%后，将培养基倒掉，用D-Hanks清洗3次，加入少量胰酶，37℃，5%CO2消化3min，待细胞在显微镜下的形态为圆形后，加入培养基小心吹打均匀，再放入37℃，5%CO2中培养。

2.5 入侵时间比对试验

A 用胰酶37℃，5%CO2消化3min消化下所需细胞，进行计数，调整细胞密度为50万/mL。

B将泡过酸，洗净高压好的盖玻片加入6孔板中，每孔加入细胞悬液2mL，分别在37℃，5%CO2和41℃，5%CO2培养2h。

C将纯化好的子孢子计数，每孔接入10万卵囊。

D分别在37℃，5%CO2和41℃，5%CO2培养每隔0.5h进行HE染色观察入侵时间。

2.6 入侵率比对试验

A 用胰酶37℃，5%CO2消化3min消化下所需细胞，进行计数，调整细胞密度为50万/mL。

B将泡过酸，洗净高压好的盖玻片加入6孔板中，每孔加入细胞悬液2mL，分别在37℃，5%CO2和41℃，5%CO2培养2h。

C将纯化好的子孢子计数，每孔接入10万卵囊。

D分别在37℃，5%CO2和41℃，5%CO2培养24h进行HE染色观察入侵率。

2.7 HE染色

A 用胰酶37℃，5%CO2消化3min消化下所需细胞，进行计数，调整细胞密度为50万/mL。

B將泡过酸，洗净高压好的盖玻片加入6孔板中，每孔加入细胞悬液2mL，分别在37℃，5%CO2和41℃，5%CO2培养2h。

C将纯化好的子孢子计数，每孔接入10万卵囊。

D分别在37℃，5%CO2和41℃，5%CO2培养培养每隔0.5h进行HE染色观察入侵时间。

2.8 培养基成分对比试验

A将VERO细胞在两块6孔板中培养至融合。

B将纯化好的子孢子计数，每孔接入10万卵囊。

C六个孔中加入不同的培养基，并将每块板的PH值分别调整为7和7.6

D如上图所示，分别在不同培养中培养每隔0.5h进行HE染色观察入侵情况。

3 结果

3.1 不同细胞系入侵时间

从结果可以看出，细胞系在入侵时间上对子孢子的影响没有显著性差异，但是明显温度可以影响子孢子的入侵时间。在41℃下，子孢子能够更快的入侵细胞。

3.2 不同细胞系不同温度入侵率

从试验结果可以看出在37℃时，VERO细胞的入侵率是最高的，其次就是PK-15细胞，其他3种细胞差异不是很显著。（见表2-4）

从试验结果可以看出在41℃时，PK15和VERO的入侵率最高，鸡胚成纤维细胞和PK细胞入侵率较高，鸡肾细胞的入侵率最低。（见表2-5）

从图中可以看到除PK，MDBK细胞外其他3种细胞在41℃时的入侵率较高，但总体比较VERO细胞的入侵率无论是在41℃还是在37℃下培养入侵率都是较高的。（见图2-2）

3.3 培养基中添加不同成分的入侵率

4 讨论

柔嫩艾美尔球虫体外培养技术中， MDBK是较为良好的上皮细胞系[1]，但却是布氏艾美尔球虫在MDBK细胞中发育不是十分良好[2]，而且小隐孢子虫在MDBK中无法发育。BHK被广泛用于培养艾美尔，并且认为是优于鸡肾细胞和火鸡肾细胞。Tierney 认为BHK，MDBK，RK-13明显适合球虫生长，较适宜用来体外培养柔嫩艾美尔球虫。有证据表明MDBK和Hep2细胞较适合体外培养弓形虫，VERO，BHK，RK13，RDA，CER对于弓形虫的体外培养不是很好。HCT-8细胞被认为是最适合体外培养小隐孢子虫，但有人比对小隐孢子虫入侵MDCK， MA-104， Hep-2 和Vero后MDCK最易于感染，在MA-104细胞中小隐孢子虫无法进行有性生殖，VERO细胞入侵最少而且无法形成滋养体。也有研究认为VELI细胞在体外培养小隐孢子虫得到的卵囊在感染小鼠时的感染力更强，更适于体外培养小隐孢子虫。弓形虫在Hela细胞中培养可以产生大量的速殖子。从实验数据可以看出虽然子孢子在入侵时间上VERO时间都较短，但差异并不是十分显著，可见在毒害艾美尔球虫体外培养中细胞系的影响不是很大。

温度对球虫的生长也有很大影响以LMH，BHK ，MDBK，HCT-8，VERO，CRFK， PK-15，RK-13，IEC-6 为载体时，41℃比较适宜球虫生长，而以Caco-2和MDCK为载体时37℃时比较适宜球虫生长。因为球虫的自然宿主的体温是41℃。有研究证明在室温和37℃时体外培养弓形虫明显影响弓形虫的感染率，而且有研究认为29℃体外培养弓形虫能够产生更多的速殖子。但是在体外培养肉孢子虫时温度對于体外培养的影响并不是很大，起到主要作用的是细胞的种类。然而目前没有对毒害艾美耳球虫体外培养细胞系的相关报道。从本实验的研究成果可见，毒害艾美尔球虫在37℃时的入侵时间明显比41℃时间要长，这可能是由于鸡的体温为41℃，虽然37℃更适宜细胞生长，但如果需要进行毒害艾美尔球虫体外培养试验建议在子孢子入侵和后续培养过程中进行温度调节，更加接近自然状态。

培养基也是影响球虫生长的一个重要因素。有研究证明添加有5%水解乳蛋白的MEM细胞维持培养液被认为是适宜柔嫩艾美耳球虫在体外培养细胞上发育的培养系统。在THP-1体外培养小隐孢子虫时在培养基中加入腺苷或是肌苷培养72h可以提高卵囊的产出，在MDBK细胞培养时加入肌苷培养24h也有同样效果。用有报道认为培养基中加入叶酸可以提高球虫的表达量。而且pH值也可以影响球虫的产量，一般认为pH7.4最适宜球虫生长。血清的含量明显影响了弓形细胞培养过程中的增殖率。从实验结果可以看出在培养基中添加肌苷可以提高子孢子的入侵率，且与其他各种添加成分比效果显著。

综上所述，笔者认为在体外培养毒害艾美尔球虫过程中，采用VERO细胞在41℃环境中，培养基中添加叶酸对下一步的试验更为有利。

参考文献

[1] Schmatz D M， Crane M S， Murray PK Eimeria tenella： parasites-spectific incorporation of 3H-uracil as a quantitative measure of intracellular development .[J] Protozool 33：109-104.

[2] Girouard， D，Gallant， J，Akiyoshi， D. Eet Failure to propagate Cryptosporidium spp. in cell-free culture [J] J Parasitol 2006，92（2）：399-400.