范才文，唐娟，黄辉，李璐，罗琴，易世江，向秋

（1.桂林医学院科学实验中心，广西桂林541004；2.桂林医学院附属医院，广西桂林541001）

抑制核转录因子κBp65对鼻咽癌C N E2细胞的生物学影响

范才文1，唐娟2，黄辉2，李璐1，罗琴1，易世江2，向秋1

（1.桂林医学院科学实验中心，广西桂林541004；2.桂林医学院附属医院，广西桂林541001）

目的探讨核转录因子κBp65（NF-κBp65）沉默对鼻咽癌的生物学作用。方法构建NF-κBp65特异性小干扰核糖核酸（siRNA）质粒表达载体（pGPU6/RFP/Neo-NF-κBp65）和阴性对照质粒表达载体（pGPU6/RFP/Neo-NC）。采用非脂质体脂类转染剂将重组质粒表达载体转入人鼻咽癌CNE2细胞，建立NF-κ Bp65沉默的稳定转染CNE2细胞株（NF-κBp65沉默组）和阴性对照细胞株（阴性对照组）；蛋白质印迹法（Western blot）分析癌细胞中NF-κBp65基因的表达水平，MTT实验及流式细胞术分析癌细胞的增殖能力和细胞周期变化；复制裸鼠移植瘤模型，分析沉默NF-κBp65对癌细胞成瘤性的影响。结果成功获得稳定转染CNE2细胞株，NF-κBp65沉默组细胞中NF-κBp65蛋白表达水平降低；NF-κBp65沉默后，CNE2细胞周期阻滞于S期，增殖速度减慢；NF-κBp65沉默组裸鼠移植瘤生长慢，重量轻，与阴性对照组和空白对照组比较，差异有统计学意义（F=14.386，P＜0.05）。结论NF-κBp65沉默能降低鼻咽癌CNE2细胞的恶性生物学行为。

鼻咽癌；核转录因子-κBp65；小干扰核糖核酸

鼻咽癌起源于鼻咽黏膜上皮，在我国南方和东南亚地区高发，由于其发病部位隐匿，早期症状不明显，确诊时多数患者已达中晚期，因此，治疗效果差，5年生存率低，主要原因是局部复发和远处转移[1]。核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）是一个核转录因子家族，静息状态下，以同源或异源二聚复合体的形式与κB的抑制因子（IκB）结合，存在于细胞质内，其中，p50/p65二聚体几乎存在于所有细胞中，p65有调节基因转录起始的结构域，并能促进p50与DNA结合[2]。当细胞受到刺激时，p50/p65复合体与其抑制因子解离，即所谓的NF-κB活化，暴露核定位信号（nuclear localization sequence，NLS）并进入细胞核内与靶基因结合，参与炎症、免疫反应和肿瘤生成等相关基因的表达与调控[3]。鼻咽癌中NF-κBp65高表达，在晚期鼻咽癌中尤为明显[4-5]。因此，NF-κBp65可能是鼻咽癌发生、发展和恶性生物学表型转化的关键因素，也可能是鼻咽癌治疗的潜在分子靶点。本研究拟采用小干扰核糖核酸（small interfering ribonucleic acid，siRNA）技术构建NF-κBp65沉默的鼻咽癌细胞株，探讨NF-κBp65沉默对鼻咽癌CNE2细胞的生物学表型影响，为鼻咽癌的分子靶点治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

无特定病原体级（specific pathogen free，SPF）BALB/c雄性裸鼠（湖南省长沙斯莱克景达实验动物有限公司），鼻咽癌CNE2细胞系（中南大学湘雅医院细胞中心），转染试剂（德国Qiagen公司），RPMI 1640培养液、MTT和G418（美国Gibco公司），胎牛血清（浙江省杭州四季青生物工程材料有限公司），兔抗人NF-κBp65一抗（美国Cell Signaling Technology公司），ECL发光液、HPR山羊IgG二抗和鼠抗人β-actin一抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料、RNase A（美国Sigma公司），蛋白裂解液、BCA蛋白定量试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）。

1.2 NF-κBsiRNA质粒表达载体构建

从Genbank数据库中获得人NF-κBp65信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）序列，设计NF-κBp65基因沉默的siRNA序列，并由江苏省苏州吉玛基因股份有限公司合成。筛选抑制NF-κBp65基因表达效果明显的siRNA序列5'-GGAC ATATGAGACCTTCAAGA-3'进行后续实验，同时设阴性对照序列5'-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。将抑制NF-κBp65基因表达的siRNA序列亚克隆于pGPU6/RFP/Neo质粒表达载体，命名为pGPU6/ RFP/Neo-NF-κBp65，即NF-κBp65沉默的质粒表达载体（NF-κBp65沉默组）。同时构建阴性质粒表达载体（阴性对照组），命名为pGPU6/RFP/Neo-NC。

1.3 细胞转染

CNE2细胞用含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养，培养条件为置37℃、5%二氧化碳CO2及湿度饱和的培养箱。用含乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化细胞，调整细胞密度后，接种于6孔板，细胞融合达70%时，将构建的质粒表达载体转入CNE2细胞（按转染试剂说明书进行操作），G418筛选14 d左右有单克隆细胞形成，在倒置荧光显微镜下观察，挑选呈红色的单克隆细胞转入24孔板中培养，获得稳定转染的CNE2细胞株。

1.4 稳定转染的CNE2细胞株鉴定

稳定转染的CNE2细胞株传代培养48h后，收集细胞，加入蛋白提取液裂解细胞20 min，分离提取细胞总蛋白，二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）法分析蛋白浓度。蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性后，采用12%的分离胶，5%的浓缩胶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。首先用80 V电压电泳，待样品条带迁移至分离胶上缘时，电压调为120V至电泳结束。蛋白转至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）采用恒流260 mA，时间为1.5 h。然后，采用5%脱脂奶粉封闭蛋白印迹PVDF膜1h，弃去封闭液，分别加入一抗NF-κBp65（1∶500）和内参β-actin（1∶1 000）；一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜4次，每次5 min，加入二抗（1∶10 000），室温孵育2 h，TBST洗膜4次，每次5 min，采用ECL化学发光法进行蛋白检测。实验设置：NF-κBp65沉默组（转染pGPU6/RFP/Neo-NF-κBp65的CNE2细胞）和NC-阴性对照组（转染pGPU6/RFP/Neo-NC的CNE2细胞），同时设空白对照组（未转染载体的CNE2细胞）。

1.5 细胞增殖分析

胰酶消化对数生长期CNE2细胞，然后制备成单个细胞悬液，细胞悬液接种于96孔板，每组设3个复孔，每孔3 000个细胞。培养24、48和72 h后，每孔分别加入20 μl MTT（5 g/L），再培养4 h。弃上清液，每孔分别加入200 μl二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），置96孔板于摇床轻轻振荡10 min后，用酶标仪测定吸光度值，波长为490 nm。然后，计算细胞生长抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。

1.6 细胞周期检测

细胞培养48 h后，胰酶消化收集细胞，低速离心弃上清液，PBS重悬洗涤细胞2次，4℃预冷70%的乙醇固定细胞≥12 h，1 000 r/min室温离心5 min，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）重悬细胞，洗涤2次，加入终浓度为100μg/ml的核糖核酸酶A（Ribonuclease A，RNase A），置37℃水浴1 h；加入终浓度为50μg/ml的PI染液，避光反应30 min后，滤网过滤，流式细胞仪检测细胞周期。

1.7 裸鼠移植瘤实验

6周龄雄性SPF级免疫缺陷BALB/c裸鼠12只，随机分成3组，每组4只。右前肢皮下接种0.2 ml鼻咽癌CNE2细胞悬液（含1×107个细胞）。每天观察动物的活动、进食情况，并检查接种部位是否有移植瘤长出。接种鼻咽癌细胞大约10 d后，肉眼可见有鼻咽癌移植瘤长出，接种40 d后，采用麻醉法处死实验小鼠，分离、摘除移植瘤并称重。

1.8 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较用t检验，多组间比较用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻咽癌C N E2细胞系

pGPU6/RFP/Neo质粒表达载体携带红色荧光蛋白基因，因此，荧光显微镜下观察，转入质粒表达载体的鼻咽癌CNE2细胞发红色荧光，经G418筛选获得稳定转染的CNE2细胞株（见图1）。

2.2 pG PU 6/R FP/N eo-N F-κBp65转染对N F-κBp65表达的抑制作用

将pGPU6/RFP/Neo-NF-κBp65质粒表达载体转染CNE2细胞，采用Western blot分析细胞中NF-κBp65基因的表达水平，结果显示：与空白对照组和阴性对照组比较，NF-κBp65沉默组NF-κBp65蛋白表达下调（见图2）。

2.3 N F-κBp65沉默对C N E2细胞增殖的抑制作用

采用MTT法分析NF-κBp65沉默组与阴性对照组和空白对照组细胞增殖的差异。本实验以空白对照组细胞的增殖无抑制，即增殖抑制率为0作参考标准，细胞分别培养24、48和72 h后，NF-κBp65沉默组与阴性对照组比较，细胞增殖抑制率增高，生长受阻，经t检验，沉默组与阴性对照比较，差异有统计学意义（见表1）。

2.4 N F-κBp65沉默对C N E2细胞周期的阻滞作用

图1 pG PU 6/R FP/N eo-N F-κB p65转染的C N E2细胞（荧光显微镜×100）

图2 蛋白印迹分析N F-κB p65的蛋白表达

表1 N F-κB p65沉默对C N E2细胞增殖抑制率的影响（%±s）

表1 N F-κB p65沉默对C N E2细胞增殖抑制率的影响（%±s）

组别7 2 h阴性对照组-2 . 9 6 7 ± 5 . 2 8 6 5 . 0 9 4 ± 0 . 9 4 1 -0 . 3 6 1 ± 2 . 7 8 8 N F -κ B p 6 5沉默组3 0 . 3 7 1 ± 4 . 5 5 4 2 2 . 0 5 8 ± 5 . 4 8 8 2 1 . 9 0 2 ± 2 . 0 4 1t值-8 . 2 7 6 -5 . 2 7 7 -1 1 . 1 6 0P值0 . 0 0 1 0 . 0 0 6 0 . 0 0 0 2 4 h 4 8 h

采用流式细胞术分析NF-κB p65沉默组与阴性对照组和空白对照组的细胞周期差异。结果显示，细胞培养48 h，NF-κB p65沉默组S期细胞为（29.790±0.832）%，与空白对照组（25.267±1.829）%和阴性对照组（24.377±1.570）%比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=11.658，P=0.009）（见表2和图3）。

表2 N F-κB p65沉默对鼻咽癌C N E2细胞周期的影响（n=3，%，±s）

表2 N F-κB p65沉默对鼻咽癌C N E2细胞周期的影响（n=3，%，±s）

G2期空白对照组6 4 . 3 2 7 ± 2 . 8 9 4 2 5 . 2 6 7 ± 1 . 8 2 9 1 0 . 4 0 3 ± 1 . 0 8 0阴性对照组6 5 . 6 5 7 ± 3 . 0 5 5 2 4 . 3 7 7 ± 1 . 5 7 0 9 . 9 7 0 ± 1 . 6 7 5 N F -κ B p 6 5沉默组5 9 . 0 0 0 ± 1 . 9 7 6 2 9 . 7 9 0 ± 0 . 8 3 2 1 1 . 2 0 3 ± 1 . 1 4 4F值5 . 1 6 7 1 1 . 6 5 8 0 . 6 6 7P值0 . 0 5 0 0 . 0 0 9 0 . 5 4 7组别G1期S期

2.5 沉默N F-κBp65对C N E2细胞成瘤能力的影响

为研究NF-κB p65沉默后对鼻咽癌细胞成瘤性的影响，笔者将鼻咽癌CNE2细胞接种与裸鼠皮下。实验结果发现，NF-κB p65沉默组裸鼠移植瘤生长慢，接种癌细胞40 d后，NF-κBp65沉默组移植瘤重量（0.350±0.259）g，低于阴性对照组（1.395± 0.404）g与空白对照组（2.933±1.085）g，沉默组与空白对照组和阴性对照组间移植瘤的重量比较，差异有统计学意义（F=14.386，P＜0.05）（见图4）。

图3 细胞周期分析图谱

图4 C N E2细胞的裸鼠成瘤性分析

3 讨论

NF-κB p65是NF-κB家族中的重要成员，在NF-κBp65的表达越高[4]。翁敬锦[5]报道，临床Ⅰ期患者鼻咽癌组织NF-κB p65的表达阳性率仅为16.7%，而Ⅳb期则高达91.2%。为探索NF-κBp65在鼻咽癌中的作用，笔者构建其特异性siRNA质粒表达载体pGPU6/RFP/Neo-NF-κB p65进行研究。虽然，GUO等[6]采用慢病毒载体短发夹（short hairpin ribonucleic acid，shRNA）转染肺癌A549细胞能抑制NF-κBp65的蛋白表达。但慢病毒载体感染对宿主细胞有一定程度的毒性，存在与宿主细胞发生重组而导致感染个体最终发病的危险。因此，笔者认为采用siRNA质粒表达载体转染和G418筛选构建抑制NF-κB p65蛋白表达的稳定转染鼻咽癌CNE2细胞系更合适。该表达载体经扩增、纯化后转染鼻咽癌CNE2细胞，NF-κBp65的蛋白表达下降，沉默效果良好（见图2）。NF-κBp65沉默后，CNE2细胞的增殖能力减弱，生长受到抑制。NF-κBp65沉默后，CNE2细胞周期阻滞于S期。HINZ等[7]发现，细胞周期素D1（Cyclin-D1）启动子区域有2个NF-κB结合位点，NF-κB的活化诱导Cyclin-D1表达，促进细胞G1/S期转换，加速细胞周期进程，促进细胞增殖、生长。ROBE等[8]报道，体外特异性抑制NF-κB的活性能阻滞胶质瘤细胞株的细胞周期，抑制肿瘤细胞生长，并诱导其凋亡。NF-κBp65沉默对CNE2细胞周期的阻滞可能是CNE2细胞增殖受阻的机制之一。

笔者将稳定转染NF-κB p65沉默的CNE2细胞株接种裸鼠皮下，发现移植瘤生长缓慢，接种40d后，麻醉法处死裸鼠，分离移植瘤，发现瘤体小，重量明显低于阴性对照组与空白对照组，差异有统计学意义（见图4）。LIN等[9]报道，体外和体内抑制IL-6/ STAT3/NF-κB信号通路，人乳腺癌干细胞增殖和微球体形成受阻，核NF-κB p65和Cyclin D1蛋白下降，肿瘤生长慢、平均重量减小。NARAYANAN等[10]用甲基亚硝基脲（MNU）和睾酮诱导的大鼠前列腺癌，肿瘤生长的早期和晚期有浸润的单核细胞，NF-κBp65表达升高。通过饮食给予塞来昔布，浸润癌组织的单核细胞减少，NF-κBp65表达抑制，癌细胞凋亡和肿瘤生长抑制。REN等[11]发现，细胞中NF-κB p65持续过表达与肿瘤细胞自主的NF-κB活化相关，维持上皮细胞的存活和软琼脂集落形成。NF-κB驱动、诱发的上皮肿瘤涉及肿瘤细胞对NF-κB信号的自主效应和慢性炎症“场效应”。NF-κB表达与活化有助于肿瘤细胞以自主的方式促进其发生与发展[12-13]。干扰NF-κB p65的表达，鼻咽癌CNE2细胞的成瘤能力降低，裸鼠移植瘤生长受抑制，恶性表型得到一定程度的控制。细胞周期阻滞可能是该效应的重要机制，但这种效应是否涉及诱导癌细胞凋亡和肿瘤细胞的NF-κB自主活化阻断，还有待深入研究。另外，实验中发现阴性对照组（转染pGPU6/RFP/Neo-NC细胞）裸鼠移植瘤生长较空白对照组（未转染载体的CNE2细胞）裸鼠移植瘤慢，这可能是质粒表达载体产生的作用，其内在的联系尚不清楚。

综上所述，NF-κB p65沉默能抑制鼻咽癌CNE2细胞的恶性表型，NF-κB p65可能是鼻咽癌治疗潜在的有效分子靶点。

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Inhibition of NF-κBp65 expression reduce malignant phenotype of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cell*

Cai-wen Fan1,Juan Tang2,Hui Huang2,Lu Li1,Qin Luo1,Shi-jiang Yi2,Qiu Xiang1
(1.Science Experimental Center,Guilin Medical College,Guilin,Guangxi 541004,China; 2.Affiliated Hospital of Guilin Medical College,Guilin,Guangxi 541001,China)

ObjectiveTo investigate the biological effects of NF-kappa B p65(NF-κBp65)on nasopharyngeal carcinoma.MethodsNF-κBp65 specific siRNA plasmid expression vector(pGPU6/RFP/Neo-NF-κB p65)and negative control plasmid expression vector(pGPU6/RFP/Neo-NC)were constructed and transfected into human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cell line by non-liposomal lipid transfection agent to establish NF-κB p65 silencing stable transfected CNE2 cell line(NF-κB p65 silencing group)and negative control cell line(negative control group).The expression of NF-κB p65 gene in cancer cells was analyzed by Western blot.The proliferation and cell cycle of cancer cells were analyzed by MTT assay and Flow Cytometry.A xenograft model in nude mice was established to analyze the tumor igenicity of cancer cells.ResultsThe stable transfected CNE2 cell lines were successfully obtained.The expression of NF-κB p65 protein was decreased in cells of NF-κB p65 silencing group.The cell cycle was arrested in S phase and proliferation was reduced after NF-κB p65 was silenced.The growth of transplanted tumor in nude mice of NF-κB p65 silencing group was slower,and weight of transplanted tumor was lighter than that in negative control group or blank control group,the difference was statistically significant(F=14.386,P＜0.05).ConclusionsMalignantbiological phenotype of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cell line could be reduced by silencing NF-κB p65.

nasopharyngeal carcinoma;NF-κB p65;siRNA

R739.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.08.002

1005-8982（2017）08-0007-05

2016-12-16

国家自然科学基金资助课题(No：81260344）；广西自然科学基金资助课题（No：2013GXNSFAA019228）；广西壮族自治区教育厅资助课题（No：LX2014274）

向秋，E-mail：guilin996@163.com