黄 鑫 黎 丽 何俊炜

(广西民族医药研究院，广西 西宁 530001)

实验研究

壮药癌痛消胶囊干预肝癌(H22)荷瘤小鼠的实验研究△

黄 鑫 黎 丽 何俊炜

(广西民族医药研究院，广西 西宁 530001)

目的：研究癌痛消胶囊对肝癌(H22)荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用。方法:60只昆明(KM)小鼠进行H22实体瘤造模后随机分6组。连续给药干预12d后观察并记录H22荷瘤小鼠日常活动的影响，测定小鼠抑瘤率及计算脾脏、胸腺、肝脏重要脏器指数；检测小鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)水平；检测H22荷瘤小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖功能。结果:癌痛消胶囊高、中、低剂量组和环磷酰胺给药组的抑瘤率分别为48%、32.7%、20.4%和41.8%，均具有明显的抑瘤作用(P<0.05)。给予癌痛消胶囊后小鼠血清中TNF-α、IFN-γ水平均显著增高(P<0.05)。癌痛消胶囊可显著促进H22荷瘤小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖。结论:癌痛消胶囊对肝癌(H22)荷瘤有明显的抑制作用，能显著提高免疫力。

癌痛消胶囊；肝癌(H22)；抗肿瘤；壮药

壮族医药作为中国传统医学中的瑰宝，以其博大精深的理论体系及独特的临床有效性而被认同。在肿瘤、中风、风湿性关节炎等复杂性疾病的治疗中具有独到的认识及有效的治疗效果，其中壮药癌痛消胶囊(壮文名称：消癌尹Siungamxin )治疗肿瘤在壮医医学及临床组方中被证明是行之有效的。壮药癌痛消胶囊是由珍珠贝肉提取物及半枝莲组成的复方药[1]。以往研究及方剂的临床表明，壮药癌痛消胶囊用于肺癌(非小细胞癌)、肝癌的治疗；亦可用于癌症疼痛辅助治疗，同时强化人体免疫机能。肝癌是最常见恶性肿瘤，患病率在我国恶性肿瘤居第1位。本实验试图建立肝癌(H22)荷瘤小鼠肿瘤模型，分别计算各实验组小鼠H22瘤块的抑瘤率及计算脾脏、胸腺、肝脏重要脏器指数变化，测定小鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)指标水平; 并检测H22荷瘤小鼠脾脏T淋巴细胞增殖功能，旨在研究癌痛消胶囊对 H22 荷瘤小鼠抗肿瘤作用，为壮药癌痛消胶囊临床治疗肝癌提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及瘤株： 将60只平均体质量为(20±2)g的健康昆明种小鼠作为造模对象，雌雄各30只，8周龄[广西医科大学实验动物中心供应，许可证号:SCXK桂2014-0002]; 小鼠肝癌(H22)瘤株由武汉大学细胞库提供。

1.2 药物与试剂： 壮药癌痛消胶囊( 广西壮医医院，批号150611)，环磷酰胺(江苏恒瑞医药有限公司，批号 14112327)，小鼠TNF-a ELISA 试剂盒(Boster Biological Technology，批号240801041255)，小鼠IFN-γELISA 试剂盒( Boster Biological Technology，批号9810111161221)。

1.3 主要仪器： 酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司，型号 MK3)，洗板机(Thermo公司，型号AC9)，高速离心机(湘仪离心机厂，型号TG17W) ，显微镜(日本，Olympus 公司)。

1.4 分组与造模： 将60只昆明种小鼠随机分为6组:癌痛消胶囊高剂量组、癌痛消胶囊中剂量组、癌痛消胶囊低剂量组、环磷酰胺给药组、H22肿瘤模型组和正常对照组，每组10只，雌性5只，雄性5只。

H22肝癌移植瘤小鼠模型的建立：常规方法复苏H22小鼠肝癌细胞，取0.2mL细胞悬液注射到雄性昆明小鼠腹腔内，连续传两代。无菌操作取第2代腹水，用无菌生理盐水稀释，调整细胞密度为1×106个/mL，用1mL的注射器在每只小鼠左前肢腋窝皮下接种0.2 mL，操作过程全部在无菌条件下进行，30 min内完毕。观察小鼠接种部位的肿瘤生长情况7d，接种部位可触及结节为接种成功[1]。

1.5 实验给药方法： 除正常对照组之外，5组小鼠均进行肝癌(H22)荷瘤移植造模。24h后，称重并根据个体重量进行药物干预:正常对照组不给予任何干预措施，每日给予生理盐水0.2mL/10g灌胃，干预治疗第给予生理盐水0.2mL/10g腹腔注射;环磷酰胺给药组给环磷酰胺80mg.kg-1，干预治疗腹腔注射环磷酰胺，给予生理盐水0.2mL/10g灌胃; H22肿瘤模型组每日给予生理盐水0.2mL/10g灌胃，干预治疗给予生理盐水0.2mL/10g腹腔注射;打开胶囊后，溶于生理盐水经人与实验动物间给药剂量换算公式，配成高剂量组(10g.kg-1)、中剂量组(6g.kg-1)、低剂量组(3g.kg-1)每日1次灌胃给药，给药治疗第1天给予生理盐水0.2mL/10g腹腔注射。给药持续12d，

1.6 实验观察指标

1.6.1 一般情况： 每天称体重，观察小鼠的死亡及自主活动、摄食、饮水、毛发、粪便、尿液及眼、耳、鼻、口有无分泌物。

1.6.2 H22荷瘤小鼠模型的抑瘤率： 造模后连续灌胃治疗12d后处死昆明种小鼠，经解剖取出H22瘤块并迅速择取胸腺、脾脏、肝脏称重，计算抑瘤率及各重要要脏器指数。抑瘤率=(肿瘤模型组小鼠瘤块的平均重量-癌痛消胶囊不同剂量给药组小鼠瘤块的平均重量)/肿瘤模型组小鼠瘤块平均重量×100%；器官指数=器官重量(mg)/小鼠体重(g)[3]。

大明路功能定位为南北方向的主干路，永乐路为支路，路口东北象限是正在建设的医疗中心一期，东南象限是规划预留的医疗中心二期，西南和西北象限是两个现状的老小区。其中医疗中心的三个出入口的作用为：大明路门口为大门，同时是急救车流入口；永乐路门口为门诊入口，东风河路门口为医疗中心后门。见图2。

1.6.3 检测各组小鼠血清中TNF-α、IFN-γ水平： 各组小鼠连续给药12 d，末次给药第2d，将小鼠断头取全血装入离心管，在室温下稳定放置30min，3000r/min离心10min，小心吸取血清，按照相应的试剂盒按说明书方法检测小鼠血清中TNF-α、IFN-γ水平。

1.6.4 癌痛消胶囊对H22荷瘤小鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力的影响 ：采用噻唑蓝(MTT)比色法[4]检测各实验组小鼠脾脏T淋巴细胞增殖状况。将小鼠脾脏研碎制成1×107个/mL细胞悬液接种到96孔细胞培养板中100μL/孔，并同时加入RPMI-1640培养液100μL，放置于37℃、5%CO2培养箱内分别培养12、24和48 h,每孔加MTT溶液，继续培养4h后终止培养并吸取掉上清液后加入二甲基亚砜(DMSO) 150μL/孔，均匀振荡10min，使结晶物尽快量融解。酶联免疫监测仪在490nm波长下测定各孔光吸收值并记录结果。

1.7 统计学方法：计量数据采用(±s)表示,采用数据处理软件SPSS19.0进行数据处理,并进行单因素方差分析,当结果为P<0.05时具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况： 在接种肝癌瘤株后7d，约85%小鼠右前腋下可触及黄豆大小瘤块。分组前荷瘤小鼠，动作敏捷，反应灵活，皮毛光滑，进食、进水与空白组无差异；随着实验的进展，H22肿瘤模型组小鼠精神萎靡,运动量减少,瘤块肿大,毛色灰暗、不清洁;环磷酰胺给药组小鼠的精神状态良好,活动基本正常,皮毛基本光洁,优于H22肿瘤模型组,肿瘤生长潜伏期为4d,肿瘤生长速度最慢; 癌痛消胶囊低剂量组小鼠精神状态一般,活动基本正常,皮毛基本光洁,优于H22肿瘤模型组,肿瘤生长潜伏期为3d,肿瘤生长速度慢于H22肿瘤模型组;癌痛消胶囊中剂量组小鼠精神状态良好,活动基本正常,皮毛基本光洁,优于癌痛消胶囊剂量组,肿瘤生长潜伏期为3d,肿瘤生长速度慢于癌痛消胶囊低剂量组; 癌痛消胶囊高剂量组小鼠精神状态良好,活动情况基本正常,皮毛基本光洁,优于癌痛消胶囊低剂量组,肿瘤生长潜伏期4d。

2.2 癌痛消胶囊对H22荷瘤小鼠抑瘤率及重要脏器指数的影响： 与正常对照组相比，H22肿瘤模型组的胸腺、脾脏指数均减少明显(P<0.05)；环磷酰胺给药组的胸腺、脾脏指数减少不明显但肝脏指数减少明显;癌痛消胶囊高剂量组的胸腺、脾脏及肝脏指数均减少不明显;癌痛消胶囊中剂量组的胸腺、脾脏及肝脏指数均减少(P<0.05);癌痛消胶囊低剂量组的胸腺、脾脏及肝脏指数均明显减少(P<0.05)。

与H22肿瘤模型组相比,环磷酰胺给药组及癌痛消胶囊高剂量组的胸腺、脾脏指数均明显提升(P<0.05);癌痛消胶囊中剂量组的胸腺及脾脏指数有增高(P<0.05),而肝脏指数均变化不明显;癌痛消胶囊低剂量组的脏器指数变化不明显。

表1 癌痛消胶囊对H22荷瘤增长抑制作用及脏器指数的影响±s,n=10)

注：与正常对照组比较，＊P<0.05 ；与模型组比较，▲P<0.05；与环磷酰胺组比较△P<0.05 。

2.3 癌痛消胶囊对H22荷瘤小鼠血清TNF-α、IFN-γ水平的影响 :与正常对照组比较，H22肿瘤模型组小鼠血清中IFN-γ、TNF-α水平均下降(P<0.05); 环磷酰胺给药组血清中TNF-α水平显著下降(P<0.05)；癌痛消胶囊中、高剂量组IFN-γ、TNF-α水平均显著升高。

与H22肿瘤模型组比较，癌痛消胶囊不同剂量给药组小鼠血清中TNF-α、IFN-γ水平均上升(P<0.05)，其中癌痛消胶囊中剂量组水平最高，环磷酰胺给药组血清中只有IFN-γ水平升高(P<0.05)。

与环磷酰胺给药组比较，癌痛消胶囊中、高给药组小鼠血清中TNF-α和IFN-γ水平均明显升高(P<0.05)，其中癌痛消胶囊中剂量组的升高水平最高，见表 2。

表2 癌痛消胶囊对H22荷瘤小鼠血清TNF-α、IFN-γ水平的影响

注：与正常对照组比较，＊P<0.05 ；与模型组比较，▲P<0.05；与环磷酰胺组比较△P<0.05 。

2.4 癌痛消胶囊对H22荷瘤小鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力的影响:12h时,与正常对照组比较，H22肿瘤模型组、环磷酰胺给药组和癌痛消胶囊低剂量组T淋巴细胞增殖能力下降(P<0.05)。与H22肿瘤模型组相比，癌痛消胶囊中、高剂量组T淋巴细胞增殖能力明显提升(P<0.05)。与环磷酰胺给药组比较，癌痛消胶囊中、高剂量组T 淋巴细胞增殖能力明显提升(P<0.05)。

24 h时,与正常对照组比较，H22肿瘤模型组、环磷酰胺给药组和癌痛消胶囊低剂量组T 淋巴细胞增殖能力均下降(P<0.05)。与肿瘤模型组比较,癌痛消胶囊中、高剂量组T淋巴细胞增殖能力提升(P<0.05)。与环磷酰胺给药组相比,癌痛消胶囊不同剂量给药组的T淋巴细胞增殖能力均明显提升(P<0.05)。

48 h时,与正常对照组比较,癌痛消胶囊不同剂量给药组小鼠脾脏的T淋巴细胞增殖能力均明显提升(P<0.05)。与H22肿瘤模型组比较，癌痛消胶囊不同剂量给药组的T淋巴细胞增殖能力均明显提升(P<0.05)。与环磷酰胺给药组比较,癌痛消胶囊不同剂量给药组的T淋巴细胞增殖能力均显著提升(P<0.05),见表 3。

表3 癌痛消胶囊对H22荷瘤小鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力的影响

注：与正常对照组比较，＊P<0.05 ；与模型组比较，▲P<0.05；与环磷酰胺组比较△P<0.05 。

3 讨论

壮药癌痛消胶囊是由珍珠贝肉经过生物提取及冷冻干燥后与植物药半枝莲组成的复方制剂。其以往研究及方剂的临床表明，对于肺癌(非小细胞癌)、肝癌的治疗；亦可用于癌症疼痛辅助治疗，同时强化人体免疫能力。本实验通过建立肝癌(H22)荷瘤小鼠模型，观察癌痛消胶囊对小鼠的日常活动及精神状态的影响，测定药物的抑瘤率、重要脏器指数、脾脏T淋巴细胞增殖功能，检测血清中TNF-α、IFN-γ含量以了解肿瘤导致的小鼠精神状态及各项指标改变，并探讨壮药癌痛消胶囊抗肿瘤作用。

机体的细胞免疫、体液免疫能力正常时，肿瘤细胞不易产生和生长。但免疫力减退时，机体内环境的稳态被打破，肿瘤发生的几率就大大增加。因此，如果能够用食品或药物增强免疫力，那么将对肿瘤的抑制与治疗产生非常积极的效果[6]。本实验结果显示给予癌痛消胶囊干预治疗后，不同剂量癌痛消胶囊给药组小鼠的日常生活状态有所改善，胸腺、脾脏指数增高，T淋巴细胞的增值能力明显增强; 癌痛消胶囊高、中剂量给药组小鼠的肝脏指数也增高。胸腺、脾脏分别是机体重要的中枢、外周免疫器官。脾脏是淋巴细胞发育、定居、增殖的场所及产生特异性免疫的基地，而胸腺产生大量的胸腺细胞是淋巴细胞的后备，这些免疫器官重量的增加可以在一定程度上反映机体的免疫能力。发挥细胞免疫功能的T淋巴细胞是在胸腺内发育成熟、脾脏内定居并在免疫应答中增殖，脾脏和胸腺指数的高低可反映T淋巴细胞的增殖能力和细胞数量的多少，可直接作为反映机体免疫功能状态的参数之一; 胸腺和脾脏分别属于中免疫器官和外周免疫器官，胸腺是T淋巴细胞成熟的场所，脾脏是成熟淋巴细胞和B细胞定居的场所，胸腺系数和脾脏系数可直观反映机体免疫功能的强弱。另外抑瘤率也验证了癌痛消胶囊可以抑制肝癌H22肿瘤的生长，并且可提高机体免疫能力，提示癌痛消胶囊对肿瘤细胞具有明显的抑制效应，其抑瘤活性可能与其免疫增强作用有关。

TNF-α是一种由巨噬细胞/单核细胞活化产生的多效细胞因子，其具很强的恶性肿瘤杀伤功能，而不损伤正常细胞[7]。TNF-α可刺激机体激活T淋巴细胞产生细胞因子和抗体，并对恶性肿瘤细胞有一定的杀伤作用，也可作用于血管内皮细胞，诱导肿瘤细胞凋亡。IFN-γ又别名为Ⅱ型干扰素，其是由活化的T细胞与NK细胞生成，IFN-γ可使巨噬细胞表面主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子的表达增加，增强 MHC抗原递呈能力[7]; 同时还能使巨噬细胞表面 Fc受体的表达增强，促进其吞噬免疫复合物及抗体包被的肿瘤细胞和病原体。此外，IFN-γ还能增强Th1细胞的细胞免疫功能，增强中性粒细胞吞噬能力，增强NK细胞的细胞毒作用。TNF-α是一种由巨噬细胞/单核细胞活化产生的多效细胞因子，其具很强的恶性肿瘤杀伤功能，而不损伤正常细胞[7]。本实验结果显示，癌痛消胶囊可显著提升小鼠血清中TNF-α及INF-γ的含量，表明癌痛消胶囊可以改善荷瘤机体细胞因子水平，使TNF-α和INF-γ处于较高水平，从而发挥抗肿瘤及调节机体免疫功能的作用。本研究发现癌痛消胶囊可通过调控细胞因子进而改善机体免疫力，实现对恶性肿瘤的抑制作用，体现在H22荷瘤小鼠瘤块的重量减少、主要免疫器官胸腺及脾脏重量增加及T淋巴细胞增殖方面，为痛消胶囊进一步临床应用提供了研究依据。

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2016年10月8日收稿

Study of Zhuang medicine AiTongXiao Capsule effect on mice Hepatocellular carcinoma (H22) tumor

HUANG Xin1LI Li2HE Jun-wei2

Guangxi ethnic medicine institute, 1.pharmacological room 2.industry development center

Objective:To study AiTongXiao Capsule on hepatocellular carcinoma (H22) inhibition of tumor in mice. Methods :60 Kunming (KM) mice were randomLy divided into 6 groups after the model was made of H22 solid tumor. Continuous to interfere with drug after 12 days of observation and record the effects of the daily activities of the H22 Tumor bearing mice and mice was measured by rate of tumor and spleen, thymus, liver is an important organ of the index calculation; to detect the serum TNF-αand IFN-γgamma levels; detection of H22 Tumor Bearing Mice spleen T lymphocytes proliferation. Results: AiTongXiao capsule of high, medium and low dose group and cyclophosphamide for treatment group tumor inhibition rate were 48%, 32.7%, 20.4% and41.8% and has obvious anti tumor effect (P<0.05). Give AiTongXiao capsule after TNF-αin mice serum alpha, gamma IFN-γlevels were significantly increased (P<0.05). AiTongXiao capsule can significantly promote spleen T lymphocyte proliferation in H22 mice. Conclusion: AiTongXiao capsule has obvious inhibitory effect on H22 tumor, can significantly improve the immunity.

AiTongXiao capsule; hepatocellular carcinoma (H22); anti tumor; Zhuang Medicine

△广西自然科学基本项目：项目任务书编号：2016GXNSFBA380009

黄鑫(1982-)，男,汉族，广西横县人，广西壮族自治区民族医药研究院助理研究员，硕士学位，主要从事中药，民族药药理研究工作。

R291.8

A

1006-6810(2017)02-0054-04