王 丹 于金倩 郑振佳 宋祥云 王岱杰 王 晓*

(1. 山东农业大学食品科学与工程学院， 泰安 271018；2. 山东省中药质量控制技术重点实验室，山东省分析测试中心，济南 250014)

梯度逆流色谱分离纯化雪菊中的3, 5-二咖啡酰奎宁酸和奥卡宁

王 丹1, 2于金倩2郑振佳1宋祥云2王岱杰2王 晓2*

(1. 山东农业大学食品科学与工程学院， 泰安 271018；2. 山东省中药质量控制技术重点实验室，山东省分析测试中心，济南 250014)

采用梯度逆流色谱技术快速分离纯化雪菊中的3, 5-二咖啡酰奎宁酸和奥卡宁，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶8∶2∶8, 2∶8∶4∶6 ; v/v)为溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，转速800 r/min，流速5.0 mL/min，检测波长254 nm。所得馏分通过电喷雾电离(ESI)质谱和核磁共振谱(NMR)鉴定化合物的结构。从200 mg粗提物中一次分离得到两个主要化合物：3, 5-二咖啡酰奎宁酸(11.2 mg)和奥卡宁(10.7 mg)，且3, 5-二咖啡酰奎宁酸为首次从雪菊中分离得到；经高效液相色谱法分析，其纯度分别为92.82%和97.55%。研究结果表明，应用梯度逆流色谱分离雪菊中的生物活性成分快速高效。

雪菊 逆流色谱 梯度洗脱 3, 5-二咖啡酰奎宁酸 奥卡宁

雪菊(Coreopsistinctoria)是菊科金鸡菊属一年生草本植物，主要分布于新疆和田地区海拔2300～3000 m的昆仑山区，具有治疗燥热、高血压、心慌、胃肠不适、食欲不振、痢疾及疮疖肿毒的作用[1]，现今已经作为一种茶饮普及。现代药理研究表明雪菊主要有抗炎、降脂[2]、降压[3]、降糖[4，5]、抗氧化[6-8]、抗病毒等活性[1]。雪菊中有效成分的提取、分离研究多集中于黄酮类化合物[9，10]和苯丙素类化合物[11，12]。传统的分离方法包括大孔吸附树脂、反相色谱柱、葡萄糖凝胶LH-20和聚酰胺柱色谱法[9,13]等。这些方法制备时间长、溶剂消耗大，且会产生死吸附，导致样品损失。高速逆流色谱(HSCCC)是没有固态载体的液-液分配色谱，根据样品在两相溶剂中分配系数的不同实现样品的分离，具有分离速度快、样品吸附低、分离重现性好等优点，已被广泛应用于天然药物成分的分离纯化[14]。

梯度洗脱可以使很宽极性范围内的混合组分实现一次性色谱分离[15]，本研究采用高速逆流色谱仪运用梯度洗脱的方式从雪菊乙酸乙酯粗提物中成功分离得到3, 5-二咖啡酰奎宁酸和奥卡宁(结构式如图1)，建立了高效、方便和快速分离方法，为其他食品中活性成分的分离提供了有效参考。

图1 雪菊中两种化合物的化学结构

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

TBE 300C高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司)；Waters2695高效液相色谱系统(配有PDA检测器，美国Waters公司)。

石油醚、乙酸乙酯和甲醇等均为分析纯(天津市四友精细化学品有限公司)；水为去离子水；高效液相色谱用甲醇为色谱纯(OCEANPAK ALEXATIVE CHEMICAL. , Ltd)；水为娃哈哈纯净水。

雪菊药材购买于山东舜元药业有限公司。

1.2 样品制备

取雪菊药材500g粉碎，过40目筛，加80%乙醇90℃回流提取两次(10倍量，2 h；5倍量，1 h)。抽滤后合并滤液，减压浓缩得乙醇提取物，加500mL水复溶，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，经减压浓缩得乙酸乙酯粗提物13.2 g，用于进一步分离研究。

1.3 两相溶剂系统和样品溶液的制备

HSCCC的溶剂系统为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(体系1为2∶8∶2∶8，v/v；体系2为2∶8∶4∶6，v/v)，分别按比例置于分液漏斗中，震荡后充分静置使其分层。分取上下相，上相作为固定相，下相作为流动相，超声除去上下相中的气泡，待用。

取200 mg乙酸乙酯粗提物，加入上述体系1中上下相各5 mL，超声溶解，用于HSCCC分离。

1.4 分配系数KD的测定

取少量样品置于10 mL试管中，加入5 mL的下相，取5 μL下相溶液利用高效液相色谱(HPLC)测定色谱峰面积A1；取溶有样品的下相2 mL加入等量的上相，剧烈振荡1 min，使样品充分溶解，静置分层，再取5 μL下相溶液用HPLC进行检测，其峰面积为A2，分配系数KD=(A1-A2)/A2。

1.5 分离和鉴定

1.5.1 HSCCC分离

将体系1中已超声脱气的固定相以20 mL/min的流速注入高速逆流色谱仪的螺旋管，待上相充满整个螺旋管后，缓慢调节主机转速至800 r/min，顺时针旋转，待转速稳定后，以5.0 mL/min的流速泵入流动相，同时开启检测器和记录仪，检测波长为254 nm；当有流动相从出口流出，即螺旋管中的上下相达到平衡时，将样品溶液从进样圈注入到色谱仪中，流动相以5.0 mL/min的流速泵入(0～70 min以体系1的下相为流动相，70～250 min以体系2的下相为流动相)，根据色谱图收集各色谱峰馏分。

1.5.2 HPLC分析和结构鉴定

雪菊乙酸乙酯粗提物和HSCCC所分离得到的各组分均用HPLC进行分析。色谱柱：RIGOL Compass C18(250×4.0 mm，5 μm)。检测波长：254 nm。流动相：甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)；梯度洗脱程序为0～25 min，30%A～35%A；25～26 min，35%A～40%A；26～36 min，40%A～47%A；36～37 min，47%A～64%A；37～42 min，64%A～73%A；42～55 min，73%A～100%A；55～65 min，100%A。流速：1 mL/min；进样量：10 μL。HSCCC分离后各组分的化学结构根据ESI-MS和NMR进行鉴定。

2 结果与讨论

2.1 HSCCC分离条件的优化

溶剂体系的选择是HSCCC分离中的关键环节，溶剂体系合适与否是由目标化合物在其中的KD来衡量的。本实验利用TLC初步确定目标组分在不同溶剂系统中的分配情况，通过HPLC测定了目标化合物在乙酸乙酯-正丁醇-水和石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水等溶剂体系中的KD。结果表明，当采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水为两相溶剂体系时，可实现目标化合物的分离。目标化合物在不同比例的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水体系中的KD见表1。

由表1可看出石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水的体积比为4∶6∶4∶6时，两种化合物的KD差异较小，各组分会很快被洗脱出来，很难实现分离；体积比为3∶7∶3∶7和2∶8∶3∶7时，两种化合物的KD差异较大，能保证各组分间具有较好的分离度，但同时B在固定相中的分配较多，若采用这两种溶剂体系会使整体的分离时间过长，B有可能不出峰，影响分离效率，因此不适合雪菊粗提物中各物质的分离纯化。在其他实验参数相同的条件下，分别应用体积比为2∶8∶2∶8(体系1)与2∶8∶4∶6(体系2)的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水的体系对雪菊粗提物进行分离纯化。结果表明体系1中目标组分A的分配系数较为理想，体系2中目标组分B的分配系数较为理想。

表1 两种化合物在不同溶剂体系中的KD值

2.2 HSCCC分离纯化的结果

分别单独尝试使用体系1和体系2进行高速逆流色谱分离，结果表明体系1的A分离效果较好，但300min时B仍未洗脱出来；体系2的A和B很快在130 min内洗脱出来，但A的纯度较低。为了节省溶剂，缩短洗脱时间，又能分离出高纯度的化合物，实验采用如下梯度洗脱方法：0～70 min以体系1的下相为流动相，70～250 min以体系2的下相为流动相进行梯度逆流色谱分离，在260 min内A和B完全洗脱出来，其HSCCC分离谱图见图2。

本实验使用梯度逆流色谱从200mg粗提物中一次性分离得到11.2 mg A和10.7 mg B，经HPLC分析，其纯度分别为92.82%和97.55%。

图2 雪菊中3, 5-二咖啡酰奎宁酸和奥卡宁的HSCCC色谱图

2.3 HPLC条件的优化

本实验在HPLC分析雪菊乙酸乙酯粗提物过程中，尝试了用不同比例的乙腈-水、甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水作为流动相，结果表明：当采用甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相在65min内进行梯度洗脱，粗提物中的主要组分可以得到良好分离。

根据1.5.2所述条件，对雪菊粗提物及HSCCC分离所得2个馏分进行检测分析，所得HPLC谱图见图3。

图3 雪菊粗提物及两个馏分的HPLC谱图

2.4 HSCCC分离得到化合物的结构鉴定

化合物A：ESI-MS，m/z517 [M+H]+；1H-NMR ( DMSO-d6，400 MHz ) δ：1.92～1.98( 2H, m, 2 X H2), 2.10～2.15 (2H, m, 2 X H6), 3.83 (1H, s, H4), 5.13 (1H, d, J =3.6 Hz, H3), 5.22 (1H, d, J = 8.0 Hz, H5), 6.17 (1H, d, J = 15.6 Hz, H8 ), 6.26 (1H, d,J = 16.0 Hz, H8 ), 6.77 (1H, d, J = 4.0 Hz, H5 ), 6.79 (1H, d, J = 4.4 Hz, H5), 7.01(2H, d, J = 8.0 Hz, H6 , H6 ), 7.07 (2H, d, J = 7.6 Hz , H2 , H2 ), 7.44 (1H, s, H7), 7.49 (1H, d, J = 14.4 Hz, H7); 13C NMR( DMSO-d6，400 MHz ) δ：35.1 (C6), 36.0 (C2), 67.9(C3), 71.0 (C4), 71.3 (C5), 72.9 (C1), 114.6 (C8), 115.2 (C2, C2),115.83(C8),116.2 (C5), 116.3 (C5), 121.6 (C6), 121.8 (C6), 126.0 (C1), 126.1 (C1),145.2 (C7), 145.6 (C7), 146.0 (C3 , C3), 148.7 (C4), 148.8 (C4), 166.0 (C9 ),166.5 (C9), 175.7 (C7)，与文献[16]中报道的3, 5-二咖啡酰奎宁酸波谱数据基本一致，故鉴定化合物A为3 , 5-二咖啡酰奎宁酸(3, 5-dicaffeoylquinic acid)。

化合物B：ESI-MS，m/z287 [M+H]+；1H-NMR( DMSO-d6，400 MHz) δ：7. 69( 1H，s，H-6′) ，7. 67 ( 1H，s，H-α) ，7. 66 ( 1H，s，H-β) ，7. 28( 1H，s，H-2) ，7. 21 ( 1H，d，J=8. 0 Hz ，H-6 ) ，6. 82 ( 1H，d，J=8. 0 Hz ，H-5) ， 6. 44( 1H，d，J = 8. 8 Hz ，H-5') ；13C-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ：192.42 (C=O)，153.99 (C-2')，153.19 (C-4')，149.41(C-4), 146.13 (C-3), 144.96 (C-β), 132.93(C-3'), 126.70(C-1), 122.79 (C-6), 121.73 (C-6'), 117.8 (C-α), 116.26 (C-1'), 114.33 (C-5), 113.80 (C-2)，108.18 (C-5')，与文献[17，18]中报道的奥卡宁波谱数据基本一致，故鉴定化合物B为奥卡宁( okanin)。

3 结论

HSCCC在天然产物分离纯化方面具有独特的优势，它相对于传统的固-液柱色谱技术，具有适用范围广、操作灵活、高效、快速等优点；而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段。

本研究采用梯度逆流色谱法对雪菊中的活性成分进行分离纯化，并建立了雪菊乙酸乙酯提取物中2种单体化合物的分离纯化方法。经过溶剂体系的选择，最终应用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水作为两相溶剂体系进行梯度洗脱分离得到了3, 5-二咖啡酰奎宁酸和奥卡宁，为进一步研究其在雪菊中的药理作用奠定了基础。

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Separation and purification of 3, 5-dicaffeoyl quinic acid and okanin fromcoreopsistinctoriaby high-speed counter-current chromatography using stepwise elution.

Wang Dan1, 2, Yu Jinqian2, Zheng Zhenjia1, Song Xiangyun2, Wang Daijie2, Wang Xiao2*

(1. School of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University, Tai＇an 271018, China; 2. Shandong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology, Shandong Analysis and Test Center, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

The extraction conditions were as follows:solvent system: petroleum ether-ethyl acetate-methanol-water (2: 8: 2: 8，2: 8: 4: 6; v/v), rotation speed: 800 r / min , flow speed:5.0 mL/min, detection wavelength:254 nm.The obtained fractions were identified by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS),1H-nuclear magnetic resonance(NMR) and13C-NMR. Two main compounds, 3, 5-dicaffeoyl quinic acid (11.2 mg) and okanin (10.7 mg) were separated from 200 mg crude extract, whose purities were 92.82% and 97.55% and analyzed by HPLC. And 3, 5-dicaffeoyl quinic acid was separated fromCoreopsistinctoriafirstly. Experimental results indicate that the method is rapid and highly efficient.

coreopsistinctoria; counter-current chromatography; stepwise elution; 3, 5-dicaffeoyl quinic acid; okanin

山东省科技发展计划(2014GZX219003, ZR2016YL006)；国家自然科学基金青年基金(21506119)

王丹，女，1989年出生，硕士研究生，研究方向为天然产物分离纯化。

＊通讯作者：王晓，男，1971年出生，研究员，研究方向为天然产物分离纯化，E-mail: wangx@sdas.org 。

10.3936/j.issn.1001-232x.2017.02.005

2016-11-23