李月秋，窦海洋，吴锦涛，齐畅，邸科前，韩媛媛，韩艳梅，*

（1.河北大学 医学综合实验中心，河北保定071000；2.河北大学 医学院，河北保定071000；3.河北大学预防医学与卫生事业管理系，河北保定071000）

碱解增敏同步荧光测猪肌肉及肾中头孢噻呋残留

李月秋1，3，窦海洋2，吴锦涛3，齐畅3，邸科前1，韩媛媛1，韩艳梅1，*

（1.河北大学 医学综合实验中心，河北保定071000；2.河北大学 医学院，河北保定071000；3.河北大学预防医学与卫生事业管理系，河北保定071000）

基于头孢噻呋碱性条件降解产物荧光强度更强，吐温－80能提高其降解产物荧光强度，建立测定猪肌肉及肾中头孢噻呋残留的同步荧光分光光度法。优化了降解条件（加热时间、氢氧化钠浓度与体积），讨论了缓冲溶液、表面活性剂种类及用量对降解产物荧光强度的影响。结果发现：4 mL 2.0 mol/L氢氧化钠溶液，加热150 min，加3 mL柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液（pH 4.2）和6 mL吐温－80溶液（0.023 3 mol/L），在1 cm荧光比色皿中，于发射波长λem 415 nm～550 nm内，△λ为85 nm条件下扫描测定，440.0 nm处读出荧光强度。应用加乙腈沉淀蛋白的方法对动物性食品进行预处理。在0.625 μg/mL～62.5 μg/mL范围内，头孢噻呋浓度与降解产物荧光强度线性关系良好，相关系数为0.999 3，检出限为270 μg/kg。加标水平在144 μg/kg～2 160 μg/kg范围内，回收率为85.09%～87.83%，RSD为0.93%～1.54%（n=3）。建立的新方法可用于动物食品中头孢噻呋残留量检测。

头孢噻呋；同步荧光法；吐温－80；碱性降解；猪肌肉及肾

随着全球化、工业化高速发展，人们生活水平不断提高，日益彰显的食品安全问题也得到了世界各国的广泛关注。在我国，食品安全现状不容乐观，兽药残留是其中一个重要方面。

头孢噻呋（Ceftiofur）又名赛得福，是第3代头孢菌素类抗生素[1]，具有广谱高效杀菌作用。现在临床上常用于肉牛、奶牛、马、猪、绵羊、山羊的呼吸道及1日龄肉鸡细菌感染的治疗。由于其经过肾脏排出，具有肾毒性，残留在食品中会对人体健康造成损害。

近年来，国内外不断探索头孢噻呋残留的检测方法。农业部公布的动物性食品中头孢噻呋残留的检测方法[2]即为高效液相色谱法（HPLC），另有牛奶[3]、牛组织中[4]头孢噻呋残留量HPLC检测方法的报道。液相色谱法重现性好，易于推广，但存在灵敏度不如联用技术，有机溶剂用量多，前处理过程繁琐等缺点。

其他方法还有超高效液相色谱法（UPLC）[5]、电分析法[6]、色谱-质谱联用技术[7-9]、免疫分析法（IAS）[10-12]、紫外分光光度法（UV）[13-14]、生物传感器法[15-16]等。UPLC法存在泵的使用寿命缩短，仪器部件容易出现问题等弊端。电分析方法具有消除样品中蛋白质干扰的优势，但是应用不是十分普遍。联用技术灵敏度有了极大提高，特异性更佳，但该技术仪器昂贵，样品处理过程复杂，对分析人员技术水平要求较高，不便应用于日常的跟踪检测。IAS法具有诸多优点，但美中不足的是假阳性率较高。生物传感器法具有携带方便、分析速度快、样品前处理简单等特点，能实现现场检测，但存在稳定性差的缺点。

荧光分析法，尤其是同步荧光法[17]具有谱图简化、峰形改善、选择性高、光散射干扰少等特点。恒（固定）波长同步荧光法在日常检测中最为常用，有利于进一步提高检测灵敏度，减少组分干扰。

有些有机物本身无荧光或荧光强度较弱，可通过一定条件水解使其转换成[18]有荧光的物质，进一步应用表面活性剂可提高荧光物质的荧光强度[19]。目前，国内外鲜见在一定条件下水解头孢噻呋，采用增敏方法提高水解产物荧光强度，并应用同步荧光法检测动物性食品中头孢噻呋残留量的报道。本研究首先筛选头孢噻呋降解反应条件，以获得荧光强度更高的水解产物。随后，应用表面活性剂对降解产物增敏，采用同步荧光法对动物性食品中头孢噻呋残留量进行测定，使其检测限能满足最大残留限量要求，建立一种能用于日常跟踪监测的方法，为更多种类药物残留的检测研究开拓新思路，指出新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

RF-5301PC荧光分光光度计、AUW120D电子天平：日本岛津；Milli-Q Advantage A10超纯化水机：法国默克密里博公司；FE20 PH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SK-1快速混匀器：中国常州国华电器有限公司；TGL-20B高速台式离心机：中国上海安亭科技仪器厂；RQ5200E超声波清洗器：中国昆山市超声仪器有限公司；YQD-37A氮气吹干仪：中国雷尔达仪表有限公司；HDM-3000B电热恒温水浴锅：中国江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.0 mg/mL头孢噻呋标准溶液：称取头孢噻呋对照品（中国药品生物制品检定所）0.1 g溶于水中，定容至100 mL棕色容量瓶中，并置于冰箱中避光冷藏保存。

硫酸、盐酸（分析纯）：北京化工厂；氢氧化钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、柠檬酸钠、醋酸、醋酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠（分析纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；十二烷基硫酸钠（SDS）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十六烷基三甲基氯化铵（CTAC）、氯化十六烷基吡啶（CPC）、吐温-20、吐温-80（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；试验用水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 猪肌肉、猪肾样品预处理

称取5.0 g样品，将其切碎匀浆，置于10 mL离心管中，加入3 mL乙腈涡旋混匀1 min，超声5 min，5 000 r/min离心5 min，上清液转移至10 mL离心管中；再向原离心管沉淀内加入3 mL乙腈，涡旋混匀1 min，超声5 min，5 000 r/min离心5 min，上清液合并至10 mL离心管中，氮吹浓缩至1 mL。移取至10 mL试管内作为待测样品。

1.2.2 样品测定

将处理好的样品置于具塞比色管中，在各管中依次加入4 mL 2.0 mol/L的NaOH溶液，沸水浴中加热150 min后取出，冷却至室温后，加入3 mL柠檬酸钠－柠檬酸缓冲液（pH 4.2）和6 mL吐温－80溶液，涡旋混匀1 min，将样品溶液分别置于1 cm荧光比色皿中，在发射波长λem 415 nm～550 nm范围内，发射波长和激发波长的波长差为85 nm（△λ=85 nm）条件下分别扫描样品，在440 nm处读出荧光强度。

1.2.3 标准曲线和检出限

配置一系列不同浓度头孢噻呋标准溶液，按照1.2.2试验方法测定，以头孢噻呋浓度为横坐标（x），降解产物荧光强度为纵坐标（y），作图建立标准曲线。标准曲线回归方程为y=6.772 9x+69.119（r=0.999 3）。结果表明：在0.625 μg/mL～62.5 μg/mL范围内，头孢噻呋浓度与降解产物荧光强度呈良好线性关系。

根据IUPAC（3δ）[19]规定，由公式：D=3×δ/k，求得检测限为270 μg/kg。

式中：D为检出限；k为工作曲线斜率；δ为11份空白溶液荧光强度标准差。

1.2.4 精密度和回收率

取市售猪肌肉样品9份，每份5 g，按其浓度80%、100%、120%分别加入头孢噻呋对照品各3份，按照1.2.1方法处理，按照1.2.2的试验条件测定，测定平均回收率和精密度。

1.2.5 稳定性

将按照1.2.1及1.2.2方法处理好的标准品溶液在避光条件下，分别在0、0.5、1、2、4、8、12、24 h内进行测定。样品荧光强度的相对标准偏差（RSD）为0.907 6%。结果表明，头孢噻呋酸解产物在24 h内稳定性良好。

2 结果与分析

2.1 同步荧光分光光度法条件选择

2.1.1 降解介质选择

探讨不同介质中头孢噻呋降解后，降解产物荧光强度大小。结果见图1。

图1 不同介质中头孢噻呋降解产物荧光强度Fig.1 Fluorescence intensities of ceftiofur’s degradation product in different degradation medium

试验表明：头孢噻呋在水、盐酸、硫酸、氢氧化钠溶液中加热，均有荧光物质产生，其中在氢氧化钠溶液中降解产物荧光强度显著高于其他介质降解产物荧光强度，因此本试验选用碱性水解产物做为测定对象。

2.1.2 波长差（△λ）选择

将两波长差（Δ λ）保持为固定值，分别在Δλ为70、75、80、85、90、100、110 nm条件下测定头孢噻呋碱性水解产物荧光强度。测定结果显示，随着波长差△λ增加，头孢噻呋碱性水解产物荧光强度呈先增长后降低趋势，在△λ=85 nm处，荧光强度最大。故以△λ= 85 nm开展后续研究。荧光与同步荧光的比较见图2。

图2 荧光与同步荧光光谱Fig.2 Fluorescence and synchronous fluorescence spectrum

由图2可知，同步荧光扫描后峰形变窄，能有效减少干扰，适当提高灵敏度。

2.1.3 加热时长选择

取头孢噻呋标准溶液置具塞比色管中，依已建立方法，考察不同加热时间（60、90、120、150、180 min）下，降解产物荧光强度。结果表明：随反应时间增加，降解产物荧光强度增强；当反应时间大于150 min时，头孢噻呋碱性介质中降解产物荧光强度达到平衡，可认为头孢噻呋已完全降解。综上，选加热时间为150 min。

2.1.4 NaOH浓度选择

取头孢噻呋标准溶液置于具塞比色管中，依照已建立的试验方法，考察NaOH浓度（1、2、3、4、5、6 mol/L）对降解产物荧光强度影响。结果见图3。

结果表明：随NaOH溶液浓度增加，体系荧光强度不断增强，当NaOH溶液浓度为2 mol/L时，体系荧光强度达到最大，所以试验选择加入2 mol/L NaOH溶液。

2.1.5 NaOH加入量选择

取头孢噻呋标准溶液置于具塞比色管中，依照已建立试验方法，考察2 mol/L NaOH体积（1、2、3、4、5、6、7 mL）对降解产物荧光强度影响。NaOH加入量对头孢噻呋降解产物荧光强度影响见图3。

图3 NaOH加入量对头孢噻呋降解产物荧光强度影响Fig.3 Effect of the volume of NaOH on fluorescence intensities of ceftiofur’s degradation product

结果如图3所示：随NaOH溶液用量增加，体系荧光强度不断增强，当NaOH溶液加入量达到4 mL时体系荧光强度最大，随后再加入则呈下降趋势，所以试验选择加入4 mL 2.0 mol/L NaOH溶液。

2.1.6 缓冲液选择

2.1.6.1 缓冲液pH值选择

按照已建立方法，考察了磷酸氢二钠-柠檬酸、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液不同pH值（2.2、3.3、4.2、5.2、6.2、7.0、8.0、9.16、10.14、10.83）对降解产物荧光强度的影响。结果表明，随着所用缓冲对pH值增大，体系荧光强度不断增强，当pH值为4.2时荧光强度最大；当pH值均为4.2时，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲对对荧光强度增强的效果明显好于碳酸氢二钠-柠檬酸钠。因此，试验选择加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液将pH值调到4.2。

2.1.6.2 缓冲液加入量选择

考察了pH值为4.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液不同加入量（1、3、5mL）对降解产物荧光强度影响。结果表明，随着所用缓冲液体积增大荧光强度有先增大后减小趋势，当体积为3mL时荧光强度最大。所以，试验选择加入3 mL pH值为4.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

2.1.7 表面活性剂选择

表面活性剂浓度达到临界胶束浓度（CMC）以上时，能发生聚合而形成胶束，形状一般为球形，将荧光物质屏蔽其中以使荧光增敏稳定，发挥提高荧光强度的作用。试验考察了不同表面活性剂（SDS、CPC、Triton100、CTAB、CTAC、吐温-20、吐温-80）对头孢噻呋降解产物荧光强度的影响。未增敏及吐温-80增敏的头孢噻呋酸解产物同步荧光扫描情况见图4。

结果表明：向反应体系中加入表面活性剂可增大荧光强度；试验中发现吐温-80、CTAB、SDS对头孢噻呋降解产物荧光强度的提高较为明显，且吐温-80稍高。故选择吐温-80作为体系增敏剂。

2.1.8 吐温-80加入量对荧光强度影响

图4 未增敏及吐温-80增敏的头孢噻呋酸解产物同步荧光光谱图Fig.4 Synchronous fluorescence Spectrum of ceftiofur’s degradation product in alkaline medium added Twain-80 and not

表面活性剂对荧光强度的增强作用与表面活性剂的浓度有关。因此，考察吐温-80不同体积（2、4、6、8 mL）对头孢噻呋降解产物增敏效果。结果显示：当吐温-80加入量为6 mL时，头孢噻呋碱性水解体系荧光强度达到最大值。所以试验选用吐温-80溶液的体积为6 mL。

综上，选择4 mL 2.0 mol/L氢氧化钠溶液，加热150 min，加3 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 4.2）和6 mL吐温-80溶液，在△λ为85 nm条件下采用同步荧光法对样品进行测定。

2.2 样品测定

2.2.1 样品预处理条件选择

称取猪肌肉样品5.0 g，将其切碎匀浆，置于10 mL离心管中，分别加入3 mL乙腈、三氯乙酸涡旋混匀1 min，超声5min，分别在3000、5000、6 000、8 000r/min的转速下离心各3、5、10、15、30 min。上清液转移至10 mL离心管中；再向原离心管沉淀内加入3 mL乙腈、三氯乙酸，涡旋混匀1 min，超声5 min分别在3 000、5 000、6 000、8 000 r/min的转速下离心各3、5、10、15、30 min，上清液合并至10 mL离心管中，氮吹浓缩至1 mL。移取至10 mL试管内作为待测样品。猪肾样品处理方法同上。结果表明：加入乙腈，转速5 000 r/min，离心5 min时，并对沉淀再次离心沉淀，合并上清液，肌肉中的蛋白质等杂质几乎完全沉淀，不会对测定造成干扰，且回收率较好。

2.2.2 精密度和回收率

根据样品实际测定值，按照1.2.4节中精密度和回收率的测定方法，平均回收率及精密度的结果见表1。

2.2.3 稳定性

按照1.2.5方法进行稳定性测定，样品荧光强度的相对标准偏差（RSD）为0.907 6%。结果表明，头孢噻呋碱解产物在24 h内稳定性良好。

2.2.4 测定结果

按照1.2.1节中样品预处理方法对样品进行处理，按照1.2.2试验条件对样品进行测定，结果见表2。

表1 平均回收率及相对标准偏差（n=3）Table 1 Average recovery and RDS（n=3）

表2 样品测定结果Table 2 Results of sample determination

3 结论

本研究探索建立碱性条件下降解，吐温-80增敏，猪肌肉及肾中头孢噻呋残留的同步荧光检测方法。此法具有稳定性好、精密度高、选择性好、仪器设备简单等特点，其检出限低于欧盟、加拿大等发达国家规定的头孢噻呋在动物性食品中的最大残留限量（肌肉1 000 μg/kg，肾6 000 μg/kg）[20]。此法可做为动物性食品中头孢噻呋残留检测的新方法，也可为动物性食品中兽药残留检测研究拓展新思路。

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Synchronous Fluorimetric Determination of Residue Ceftiofur in Pig Muscel and Kidney by Alkaline Degradation and Sensibilization

LI Yue－qiu1,3，DOU Hai－yang2，WU Jin－tao3，QI Chang3，DI Ke－qian1，HAN Yuan－yuan1，HAN Yan－mei1，*
（1.Center of Medical Comprehensive Experimental，Hebei University，Baoding 071000，Hebei，China；2.School of Medicine，Hebei University，Baoding 071000，Hebei，China；3.Preventive Medicine and Health Management，Hebei University，Baoding 071000，Hebei，China）

A new synchronous fluorimetric method was developed for the determination of trace ceftiofur in pig muscel and kidney，which was based on the stronger fluorescence intensity of ceftiofur′s degradation product in the alkaline condition and the fluorescence intensity was improved by Tween－80.The degradation conditions（such as heating time，the volume and concentration of sodium hydroxide）were optimized.The effect of types and amounts of surface active agent and buffer on the fluorescence intensity of degradation product was discussed.The results showed that the optimum conditions were 4 mL 2.0 mol/L sodium hydroxide，heating time of 150 min，the buffer of 3 mL citric acid－sodium citrate（pH 4.2）and 6 mL Tween－80 solution（0.023 3 mol/L）. The standard and sample solutions were added into 1cm fluorescence cuvette，Synchronous fluorescence spectrums were scanned from 415 nm to 550 nm，△λ was 85 nm and then the fluorescence intensities were read at 440 nm.The proteins in food sample were precipitaded by acetonitrile.The results showed that in the range of 0.625 μg/mL－62.5 μg/mL，the concentration of ceftiofur and the fluorescence intensity of its degradation product had a good linearity with the correlation coefficients of 0.999 3.The detection limit was 270 μg/kg.At spikedlevels of 144 μg/kg to 2 160 μg/kg，the sample recovery ranges from 85.09%to 87.83%，the relative standard deviation was 0.93%to1.54%（n=3）.The results demonstrated that the new method proposed in this work could be used for the determination of residue ceftiofur in animal food.

ceftiofur；synchronous fluorescence spectrophotometry；Tween-80；alkaline degradation；pig muscel and kidney

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.027

2016-09-03

河北省省级科技计划自筹经费项目（15275511）；河北省自然科学青年基金（B2016201002）；河北省高等学校科学技术研究青年基金项目（QN201608）；河北省2016医学科学研究重点课题（20160048）；保定市科学研究与发展计划项目（15ZG049）；2016年国家级创新创业训练计划项目（201610075017）

李月秋（1977—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：食品有害污染物残留分析。

*通信作者：韩艳梅（1964—），女（汉），教授，硕士，研究方向：生理与病理生理。