胡霞　徐维红　刘佰明　邹德玉　许静杨　刘晓琳　白义川　谷希树

摘要：小菜蛾是最早对Bt毒蛋白产生抗性的重要农业害虫之一，而膜结合碱性磷酸酶是小菜蛾体内疑似Bt毒蛋白的直接受体之一。我们在之前的工作中克隆了小菜蛾碱性磷酸酶编码基因PxALP1，本研究对该基因的时空表达谱进行了分析。在小菜蛾所有生命阶段中，PxALP1基因在3龄幼虫中表达水平最高；而在小菜蛾3龄幼虫不同组织中，PxALP1基因在中肠中表达水平最高，这些都可能与PxALP1基因对Bt毒蛋白产生抗性的生物学功能密切相关。

关键词：小菜蛾；PxALP1；碱性磷酸酶；Bt毒蛋白受体；表达谱

中图分类号：S436.341.2+4：Q786 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）04-0001-04

Analysis of Plutella xylostella ALP1 Gene Expression

Patterns at Different Time and Space

Hu Xia， Xu Weihong， Liu Baiming， Zou Deyu， Xu Jingyang， Liu Xiaolin， Bai Yichuan， Gu Xishu

（Tianjin Institute of Plant Protection， Tianjin 300384， China）

Abstract The diamondback moth， Plutella xylostella （L.）， is one of the important agricultural pests firstly producing resistances to Bt toxin. The membrane bound alkaline phosphatase is a potential direct receptor of Bt toxin in diamondback moth. We had cloned the coding ORF of Plutella xylostella alkaline phosphatase gene PxALP1 in previous works， so we analyzed the expression patterns of this gene at different time and space in this paper. Through the whole life span of Plutella xylostella， PxALP1 gene had the highest expression level in the 3rd instar larvae； and among all the tissues and organs of the 3rd instar larvae， PxALP1 gene had the highest expression level in the midgut. The expression patterns of PxALP1 gene might be closely related to the resistant function of Bt toxin.

Keywords Plutella xylostella； PxALP1； Alkaline phosphatase； Bt toxin receptor； Expression patterns

小菜蛾[Plutella xylostella （L.）]属于鳞翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae），又被称为菜蛾、吊丝虫等，是一种为害十字花科蔬菜的世界性害虫，寄主多达40种以上，在我国各地均有分布[1]。小菜蛾主要以幼虫为害十字花科蔬菜，严重影响十字花科蔬菜的产量和品质。化学药剂一直是防治小菜蛾的主要手段，频繁用药和小菜蛾本身世代短、繁殖能力强的特点导致小菜蛾成为抗药性最为严重的害虫之一[2]。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）毒素蛋白是目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂，在世界范围内得到广泛应用[3-5]。编码Bt杀虫蛋白的基因也作为最主要的杀虫基因转入到多种重要粮棉作物中，在害虫防治中起着巨大作用[6，7]。但是小菜蛾亦能对其产生抗药性，并且是最早发现田间种群对Bt毒素产生抗药性的害虫。深入研究小菜蛾对Bt毒素的抗性机理，是有效防治害虫的一个新思路[8，9]。

鉴定Bt毒蛋白在农业害虫体内的作用靶标，明确其抗性机理是当前农业昆虫学领域的研究热点。已有研究显示，在多种昆虫体内碱性磷酸酶是Bt毒蛋白的直接受体，但在重要农业害虫小菜蛾中，碱性磷酸酶的编码基因及其生物学功能尚很少有人研究[10-13]。在以往工作中，我们成功克隆了小菜蛾的碱性磷酸酶基因PxALP1，并对其进行了生物信息学分析[14]。本研究拟利用Real-Time PCR建立检测PxALP1基因表达量的方法，并在小菜蛾不同生命阶段和不同组织中检测PxALP1基因的表达水平，以期为阐明PxALP1在小菜蛾对Bt毒素产生抗性的分子机理提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

本试验所用小菜蛾为天津市植物保护研究所室内饲养的敏感种群，用无虫甘蓝苗继代饲养20代以上，饲养温度为（25±1）℃，相对湿度为60%～70%，光周期为 16L∶8D。根据试验需要取不同虫态及组织供试。

1.2 主要试剂

TRIzol和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo Fisher公司，Real-Time PCR Kit购自ABI公司。引物由金唯智生物科技有限公司合成。

所用引物序列为PxALP1-qPCR-F：5′-CGGCATCGTGACGACATCAC-3′；PxALP1-qPCR-R：5′-CCGGGCTCGTTCTCCAGCAG-3′；EF1α-qPCR-F：5′-GCCTCCCTACAGCGAATC-3′；EF1α-qPCR-R：5′-CCTTGAACCAGGGCATCT3′。其中，引物PxALP1-qPCR-F和PxALP1-qPCR-R用于检测靶基因PxALP1；引物EF1α-qPCR-F和EF1α-qPCR-R用于检测组成型表达的延伸因子EF-1α（elongation factor-1α），为本试验的内参基因[15]。

1.3 小菜蛾总RNA的提取和cDNA第一链的合成

取小菜蛾幼虫/成虫50 mg或分离的各组织10 mg，液氮冷冻研磨后，用Trizol法提取小菜蛾总RNA，具体步骤参照Thermo Fisher公司的TRIzol试剂说明书，最后溶解于 30 μL DEPC水中，用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，直接使用或-80℃保存。

取1 μg总RNA，参照Thermo Fisher公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书，以Oligo（dT）18作为逆转录引物合成cDNA第一链。

1.4 Real-Time PCR方法

以cDNA样本为模板，使用SYB Green PCR Kit试剂盒进行Real-Time PCR，检测各样本中PxALP1和内参基因EF-1α的表达量，根据Real-Time PCR反应曲线得到各样本目的基因和内参基因的Ct值 （threshold cycle number，域值循环数），每样本测3次取平均值，采用ΔΔCt法进行相对定量，计算PxALP1基因的相对表达量和沉默效率。Real-Time PCR反应程序为：50℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。

1.5 统计分析方法

应用SPSS 18.0统计分析软件，对试验结果使用χ2检验进行分析，P<0.05为统计学差异显著。

2 结果与分析

2.1 PxALP1基因在小菜蛾不同生命阶段中的表达水平检测

分别取小菜蛾卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫、蛹、雌性成虫和雄性成虫的全部组织提取总RNA，并逆转录为cDNA，通过Real-Time PCR检测PxALP1基因在小菜蛾不同生命阶段中的相对表达水平。

Real-Time PCR的扩增曲线见图1，熔解曲线见图2。将Real-Time PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示PCR产物均为单一目标条带（图3），说明Real-Time PCR能够特异表征目标基因和内参基因的表达水平。基于此，我们通过ΔΔCt法进行相对定量，计算PxALP1基因在小菜蛾不同生命阶段中的表达水平。结果如图4所示，PxALP1基因在小菜蛾卵、各龄幼虫、蛹和雌雄成虫中均有表达，但在3龄幼虫中表达水平最高，是其在卵中表达水平的20倍。

2.2 PxALP1基因在小菜蛾不同组织中的表达水平检测

取PxALP1基因表达水平最高的3龄幼虫，将其解剖为头部、胸部、腹部、前肠、中肠、后肠、脂肪体和去肠道后表皮等不同组织，分别提取总RNA，并逆转为cDNA，同样通过Real-Time PCR方法检测PxALP1在小菜蛾不同组织中的表达分布情况。结果如图5所示，发现PxALP1基因在小菜蛾中肠表达水平最高，是其在頭部表达水平的35倍。

3 讨论与结论

处于不同生命阶段的小菜蛾基因表达谱差异很大，对转Bt基因植物的敏感性也极不相同，因此有必要对PxALP1基因在小菜蛾不同生命阶段中的表达分布情况进行探讨。本研究通过Real-Time PCR检测了PxALP1基因在小菜蛾卵、1龄

幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫、蛹、雌性成虫、雄性成虫期的表达分布情况，发现该基因在小菜蛾的卵、各龄幼虫、蛹和雌雄成虫中均有表达，但在3龄幼虫中表达水平最高，是其在卵中表达水平的20倍。

此外，基因的表达具有极大的组织特异性，PxALP1基因在小菜蛾不同组织中的表达量也具有极大的差异。本研究通过Real-Time PCR检测了PxALP1基因在小菜蛾3龄幼虫头部、胸部、腹部、前肠、中肠、后肠、脂肪体和去肠道后表皮等不同组织中的表达分布情况，发现该基因在小菜蛾3龄幼虫的中肠中表达水平最高，是其在头部表达水平的35倍。

小菜蛾低龄幼虫一般对Bt较为敏感，高龄幼虫具有较强的Bt抗性。我们前期工作揭示了PxALP1基因编码的膜结合碱性磷酸酶很可能是Bt毒蛋白在小菜蛾体内的直接受体之一[14]，本研究进一步发现PxALP1在3龄幼虫中肠中表达水平最高，暗示PxALP1基因可能在小菜蛾对Bt毒素产生抗性过程中具有一定作用，具体机理有待进一步研究。

参 考 文 献：

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