李玉萍+罗凤霞+史慧梅

摘要：以春兰“紫萼”×大花蕙兰“日本绿”杂交种子萌发所得的原球茎为材料，采用N6、KC、1/2MS等3种基本培养基配合以6-BA、KT和NAA的不同浓度设计正交试验，筛选杂交种原球茎增殖的适宜培养基。结果表明：基本培养基是影响杂种后代原球茎增殖的首要因素，N6增殖效果最好；3种外源激素对原球茎的增殖率影响都极显著，影响由大到小顺序为NAA>KT>6-BA，NAA与6-BA浓度为1：5或1：15的比例，对原球茎增殖效果最好；春兰“紫萼”×大花蕙兰“日本绿”杂交种原球茎增殖最适宜培养基为N6+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L KT+0.5 mg/L 6-BA或N6+0.1 mg/L NAA+0.1mg/L KT+1.5 mg/L 6-BA。

关键词：春兰；大花蕙兰；原球茎；增殖

中图分类号：S682.310.3 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2016）01-0053-03

杂交育种是兰花育种最重要的方法，利用该方法已培育出10万多个洋兰新品种。春兰（Cymbidium goeringii）为兰属多年生常绿地生草本，花单生，少数2朵，花葶直立，花小，直径4～5 cm，花为浅黄绿色、绿白色、黄白色，香浓。春兰高雅幽香，具有很高的观赏价值，在我国栽培已有2000多年。大花蕙兰（Cymbidium hybridium）是以兰属中的一些附生性较强的大花种为亲本获得的人工杂交种，是对兰属中通过人工杂交培育出的色泽艳丽、花朵硕大的品种的一个统称。全世界兰属植物近70种，中国约49种，目前用来作杂交亲本的原生种有近20种，主要是大花的附生类以及少量的地生类。兰属植物的果实为蒴果，其形状、大小常因亲本或原生种不同而有较大的差异。但其种子均十分细小，种子内的胚通常发育不完全，且几乎无胚乳，在自然条件下很难萌发，现代育种多采用离体胚培养。大量扩繁的有利阶段是原球茎的增殖期，本试验采用多因素正交试验，从基本培养基以及外源激素种类及其浓度探讨了春兰与大花蕙兰杂种原球茎增殖的培养基，旨在为春兰与芳香型大花蕙兰杂交育种提供基础。

1材料与方法

以春兰“紫萼”×大花蕙兰“日本绿”杂交种子萌发所得的直径在0.2～0.3 cm生长旺盛的原球茎（protocorm like-body，简称PLB）为外植体进行增殖培养，对基本培养基、NAA、6-BA和KT进行4因素3水平的L₉（3⁴）正交试验，各因素水平见表1。每处理接种30个原球茎，重复3次。

通过极差分析法找到较好的增殖培养基，在此基础上调整培养基再次进行L₉（3³）正交试验，60 d后再次统计增殖情况，并用SPSS统计软件进行方差分析，以邓肯氏（Duncans）新复极差法测验差异显著性，以得到更适宜原球茎增殖的培养基配方。

注：以上培养基加入蔗糖30 g/L、琼脂8 g/L，调节pH值5.6，121℃高温灭菌15 min。培养环境为温度（25±2）℃，光照12 h/d，光强2 0001x。接种60 d后统计原球茎增殖情况，增殖系数=增殖后的原球茎数/接种原球茎数。2结果与分析

2.1L₉（3⁴）正交试验增殖结果分析

在培养过程中，原球茎随着自身的不断增殖而逐渐形成簇生型原球茎团（图1），统计原球茎接种60 d后的增殖情况，结果见表2。

由表2可知，B4培养基的增殖系数最高，为6.56，明显高于其他处理，其次是B1，增殖系数为4.84，B5培养基和B6培养基的增殖系数基本一致，差异不明显，而B7培养基的增殖系数最小，仅为3.20。极差分析结果表明，基本培养基对原球茎增殖影响最大，其次是NAA、KT，影响最小的因子是6-BA。3种基本培养基中，N6的增殖效果最佳，其次是1/2MS。极差分析结果表明，4个因子最佳组合为N6+0 mg/LNAA+1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/LKT，此组合即为B4培养基。试验结果与极差分析都表明，原球茎增殖效果最优的培养基为N6+1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L KT。

2.2 L₉（3³）正交试验增殖结果分析

在B4培养基基础上，对其进行优化，进一步研究各激素水平对原球茎增殖的影响。以N6为基本培养基，对NAA、6-BA、KT进行3因素3水平正交试验，每处理接种30个原球茎，重复3次，60 d后增殖情况统计见表3。用SPSS软件对增殖数据进行方差分析，结果见表4。对3因素进行多重比较，结果见表5。

对正交试验9个处理进行多重比较，其差异显著性水平与增殖系数指标的比较见图2。由图2可知，原球茎增殖系数最高的培养基是B15，达到了9.22，增殖系数最低的为B12，仅为5.07。B13、B14、B15与B10、B11、B12差异极显著，表明培养基内添加适量的NAA可促进杂交种原球茎的增殖。B16与B17、B18差异极显著，表明在NAA浓度相同时，添加一定量的6-BA和KT可提高原球茎的增殖系数。

3结论与讨论

兰花大量扩繁的有利阶段是原球茎的增殖期，此时期是提高繁殖系数的核心。基本培养基、植物激素的种类与浓度等都对原球茎的增殖有着至关重要的影响。本试验结果表明，基本培养基是影响春兰“紫萼”×大花蕙兰“日本绿”杂种后代原球茎增殖的首要因素，这与鲁迪研究春剑与大花蕙兰杂交原球茎增殖培养所得试验结果一致。陈小强等认为1/2MS培养基有利于大花蕙兰原球茎的增殖。本试验发现，原球茎在N6、1/2MS、KC等3种培养基上培养，N6的增殖系数最高，这与陈小强等的研究结果有所不同。这可能是因为N6培养基与1/2MS、KC培养基所含的无机盐成分与离子浓度不同。N6培养基是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物的花药培养而设计的，其特点是离子浓度较低，KNO₃（NH₄）₂SO₄含量高，不含鉬，目前在兰花类组培中也得到了广泛应用。1/2MS培养基虽是将MS培养基大量元素减半，但其离子总量仍相对较高，不利于原球茎的增长。同时KC培养基与1/2MS、N6培养基相比，可能是因其Ca²⁺浓度较高，抑制了原球茎的增长。

在组织研究中，细胞分裂素类物质主要作用是促进细胞分裂和器官分化等，而生长素类物质主要是配合一定比例的细胞分裂素诱导不定芽的形成。因此大多研究者认为原球茎增殖阶段可以适当提高6-BA浓度并降低NAA的浓度。梁一池等认为KT和NAA 2种外源激素配合使用可以对内源激素产生影响，有利于细胞分裂。杨玉珍等研究也发现，相同浓度的NAA配合下，大花蕙兰对KT的敏感程度高于对6-BA的敏感程度，低浓度的KT可明显促进原球茎的增殖。本研究中，NAA、KT、6-BA等3种外源激素对原球茎的增殖率影响都极显著，影响顺序为NAA>KT>6-BA，这与前人研究较一致。陈丽等在对墨兰的研究中发现0.5 m/L NAA+1.0 mg/L 6-BA即1：2的配比，有利于墨兰根状茎的增殖，本研究发现0.1 mg/L NAA+0.5或1.5 m/L 6-BA，即1：5或1：15的比例，对原球茎增殖效果最好。这可能是因为不同兰花种类原球茎生长机理有所差异，或者是因为培养基中添加了较低浓度的KT，其具体原因有待进一步研究。

同时本研究仍存在一些不足，本研究所用材料来源于春兰“紫萼”×大花蕙兰“日本绿”杂交种胚无菌播种萌发形成的原球茎，此类原球茎是否与组培中由茎尖、腋芽等诱导出的原球茎有所不同，仍有待以后进一步探究。因此，本研究结果仅适用于春兰与大花蕙兰的有性繁殖，在育种实践中具有重要的意义。此外由于材料有限，本研究只对春兰与大花蕙兰1个杂交组合所得原球茎的增殖做了研究，所得原球茎增殖培养基是否适应于其他组合，还有待进一步确定，但仍可为春兰与大花蕙兰杂种原球茎生长与发育提供一定参考。