何姗姗　赵婷婷　姜景彬　李景富　许向阳

摘要：以含有Cf-19基因的番茄抗叶霉病品种CGN18423为材料，运用RT-PCR技术克隆番茄抗叶霉病相关基因细胞色素P450 90A1-like（CYP 90A1-like）部分序列，片段长295 bp；以番茄八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase，PDS）基因作为阳性对照，片段长349 bp。测序结果表明，序列与番茄同源性达100%；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果显示，在番茄感染叶霉病后，隨时间延长CYP90A1-like基因相对表达量呈上调趋势，说明该基因在番茄抗叶霉病过程中有重要作用；以烟草脆裂病毒（TRV2）为载体，成功构建CYP 90A1-like、PDS基因的病毒诱导基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）重组载体。构建的pTRV2-CYP 90A1-like、pTRV2-PDS重组载体将为下一步利用VIGS技术在番茄上研究CYP 90A1-like基因与番茄抗叶霉病的关系奠定试验基础。

关键词：番茄；细胞色素P450 90A1-like基因；八氢番茄红素脱氢酶（PDS）；病毒诱导的基因沉默（VIGS）

中图分类号：S641.203 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0029—03

病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）是指携带目标基因片段的重组载体在通过各种方法侵染植株后，可诱导植物内源基因下调表达或者不表达的现象。目前该技术广泛用于番茄、烟草、小麦、水稻，在大麦、马铃薯等作物上的应用也有报道。研究表明，利用VIGS技术已经使得一些基因在番茄中被成功沉默，如NPR1、TGA1a、NbCA1、NTF6、MEK1、MEK2等多个抗病相关基因。VIGS具有技术简单、研究周期短、侵染效率高、不需要遗传转化等优势，这种反向遗传学新技术已成为一种低成本、高通量地鉴定植物中各种基因功能的新技术，在植物功能基因组学研究中发挥着重要作用。

1995年，Kumagai等利用人工构建的植物内源基因片段在本氏烟中首次将PDS基因进行沉默。八氢番茄红素脱氢酶（PDS）是影响类胡萝卜素合成的限速酶之一，常将该基因作为评价VIGS是否成功的参照基因。在番茄、柑橘等花或果实以类胡萝卜素为主要色素的植物中，随着类胡萝卜素含量增加，PDS基因表达量呈上调趋势。若该基因被成功沉默，植株将会表现幼嫩叶片漂白的症状，表型变化易于观察辨别。

细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）广泛存在于动物、植物、细菌、真菌等细胞内，在植物体内参与植物激素等化合物的生物合成、代谢解毒以及抗病等重要生理活动。Frear等于1969年首先在棉花中发现细胞色素P450，随后在小麦、水稻和拟南芥等作物中也陆续分离出细胞色素P450。细胞色素P450的研究主要集中于其在生物体内发挥的功能，它不仅参与植物体内的基础代谢，更重要的是参与植物的次生代谢，在代谢过程中可以产生很多重要的、可以抵抗病虫害以及环境胁迫的次生代谢产物。

本研究分别构建CYP90A1-like、PDS基因的VIGS载体并对载体进行鉴定，以证明其可靠性，为下一步分析基因沉默后的植株感病情况提供试验材料，以便进一步探讨该基因与番茄抗叶霉病之间的关系。

1材料与方法

1.1材料

以番茄含有Cf-19基因的抗病品种CGN18423为试验材料，叶霉菌生理小种为1.2.3.4.（笔者所在实验室提供）。番茄试验材料在东北农业大学园艺实验站温室内常规种植。在苗期，生长至四叶一心时取新鲜叶片用于基因片段克隆。分别采集感染叶霉菌0、3、5、7、9、15、20 d后的阳性植株与对照组植株叶片，用于实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。以上材料采集后均立即用液氮冷冻，并在-80℃保存备用。

1.2试验方法

1.2.1番茄叶片总RNA提取及cDNA第1链合成按照笔者所在实验室改良的Trizol法进行总RNA提取，用超微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。利用cDNA第1链合成试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）进行反转录。

1.2.2 CYP 90A1-like、PDS基因片段的克隆、测序根据GenBank中公布的番茄CYP 90A1-like基因片段序列（登录号：JZ717738），设计特异引物，引物序列见表1。20μL CYP90A1-like基因片段的PCR扩增体系为：各2μL cDNA和上、下游引物，10μL 6×Taq MasterMix、4μLddH₂O。扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10 min。

电泳检测并进行胶回收后，基因片段分别与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌。阳性菌落提取质粒后进行酶切验证、测序。

1.2.3实时荧光定量（qRT-PCR）检测CYP 90A1-like基因与抗叶霉病的相关性分别采集幼嫩叶片，提取感染叶霉菌0、3、5、7、9、15、20 d的阳性植株与对照组植株的RNA，以番茄肌动蛋白基因Actin为内参基因，每个样品重复3次，进行实时荧光定量PCR，检测感病后CYP90A1-like基因的相对表达量。

1.2.4载体的构建及鉴定 CYP 90A1-like基因采用限制性内切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切，连接到同样用EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切的pTRV2载体中，将双酶切之后的产物进行胶回收处理，转化大肠杆菌。

将菌液提取质粒PCR进行双酶切鉴定，筛选阳性克隆提取质粒进行测序验证，阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，获得正确序列的载体质粒即为重组载体pTRV2-CYP90A1-like、pTRV2-PDS。

2结果与分析

2.1番茄叶片总RNA提取质量分析

按照笔者所在实验室改良的Trizol法提取番茄叶片总RNA，用超微量分光光度计检测结果显示，D_260nm/D_280nm范圍为1.94～1.98。图1琼脂糖凝胶电泳结果显示，28S、18S2条带明亮、无拖带，且28 s条带亮度是18 s条带的2倍，表明RNA质量良好，可以用于后续反转录试验。

2.2番茄CYP90A1-like、PDS基因片段的克隆及测序结果

对基因片段PCR扩增结果进行电泳检测，图2琼脂糖凝胶电泳结果显示，条带清晰，与预期大小一致。通过双酶切，与载体连接、测序，图3、表2序列分析结果显示：成功克隆出CYP 90A1-like、PDS基因片段，可用于构建病毒载体。

2.3 CYP90A1-like基因实时荧光定量（qRT-PCR）分析

提取感染叶霉菌0、3、5、7、9、15、20 d后阳性植株与对照组植株的叶片RNA，反转录成第1链cDNA进行实时荧光定量PCR检测。结果表明：阳性植株的CYP 90A1-like基因的表达量相对于对照组有明显上升，且随感病时间的延长表达量呈上升趋势（图4）。说明该基因与番茄抗叶霉病相关，并在抵抗叶霉病过程中有重要作用。

2.4基因的VIGS重组载体构建与鉴定结果

将基因片段连接大肠杆菌感受态，涂板过夜，提取质粒，与病毒载体用限制性内切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ进行双酶切，T₄DNA连接酶连接；然后将重组病毒载体质粒转化大肠杆菌，经菌液PCR以及双酶切鉴定与预期结果一致，为阳性克隆，详见图5、图6。

3讨论与结论

番茄叶霉病在番茄中普遍存在，可迅速传播，对番茄果实产量及品质都会产生不利影响。因此，研究番茄抗叶霉病相关基因对于抗病品种改良等方面具有重要的经济价值和社会效益。通过对抗病相关基因的研究也可以为抗病品种选育提供新的思路和途径，也可为其他园艺作物的研究提供借鉴。

番茄CYP 90A-like基因是参与抗叶霉病过程的关键基因，在抗叶霉病过程中起到关键作用，验证该基因的功能也具有十分重要的意义。传统研究植物基因功能的方法存在研究周期长、转化效率低等缺点，而VIGS技术能够突破这些问题，使其成为研究植物基因功能优质、高效的新手段。烟草脆裂病毒（TRV）是VIGS中常用的病毒载体，利用TRV载体进行基因沉默时，可通过种子将沉默的表型遗传给后代，而且其沉默的表型可以维持2年。

本研究通过对番茄CYP 90A1-like、PDS基因片段的克隆及序列分析，进行酶切鉴定，构建了pTRV2-CYP 90A1-like、pTRV2-PDS重组病毒载体。期望下一步在番茄上通过VIGS技术实现CYP 90A1-like基因沉默，研究该基因对番茄抗叶霉病的作用，从而进一步丰富和扩大VIGS技术在番茄中的应用范围，旨在为后续研究番茄抗叶霉病基因和相关基因的功能提供试验材料，为将来从分子层面调控番茄抗叶霉病提供科学依据。