侯志丽，叶 静，梅早仙，白大鹏，吴 琦

(天津市海河医院 天津市呼吸疾病研究所，天津300350)

结核分枝杆菌生物被膜体外模型的建立

侯志丽，叶 静，梅早仙，白大鹏，吴 琦*

(天津市海河医院 天津市呼吸疾病研究所，天津300350)

目的 本试验探讨如何建立结核菌生物被膜体外模型。方法 选取生长良好的非耐药结核菌在罗氏固体培养基中复苏，在7H9 OADC培养基中重新培养1周，使其活力相同，配置苏通培养基分别在烧瓶及孔板中培养结核菌观察生物膜的生长情况。结果 36株结核菌在孔板中培养时使用封口膜的全部培养出生物膜，而未使用封口膜的均培养失败。烧瓶中培养：在培养3周时需要松开瓶盖，否则生物膜生长不良。时间：培养2周时可看到有生物膜出现，5周时生物膜培养成熟。结论 结核菌有生物被膜，通过体外培养可以成功获得。

生物被膜；结核分枝杆菌

(ChinJLabDiagn,2017,21:0686)

细菌生物被膜(bacterial biofilm，BF)是细菌为了适应自然环境，在生长过程中粘附在附着物表面或破损组织表面而形成的特殊存在形式，是由多个细菌组成的一种膜状结构。其化学成分主要是多糖基质、纤维蛋白质、脂蛋白等，它们包裹着菌细胞。生物被膜是细胞间相互协调作用的多细胞群体，是细菌的一种保护性的生长模式，具有结构和代谢的复杂性。生物被膜中所包裹的细菌，由于被膜的屏障保护作用，能抵御外来的攻击，并且能逃避机体自身的免疫攻击，使细菌不被机体内的抗体溶解和巨噬细胞吞噬，这是造成持续感染的主要原因之一，多数的人类细菌性感染与生物被膜都十分相关。形成生物被膜的黏附细菌群同时也可以释放出生长迅速的浮游细菌，这能成为潜在的“菌巢”，为细菌的生长提供了另一个有利的环境。

生物膜是细菌为了适应自然环境而采取的生存战略,但正是细菌生物被膜的这些特性，从而导致了严重的临床问题[1,2]。对生物被膜的研究，可以用来在诊断感染性疾病，针对性治疗感染性疾病方面起很大的作用。近些年,美国国立卫生研究所(NIH)也为此投入大量研究资金[3,4]。

1 资料与方法

本实验，选取生长良好的非耐药结核菌36株在罗氏固体培养基中复苏，在7H9 OADC培养基中重新培养1周，使其活力相同，配置苏通培养基分别在烧瓶及孔板中培养结核菌观察生物膜的生长情况。36株菌每一株均需准备4份进行培养，1、2组在孔板中培养，第1组孔板缝隙处用封口膜包裹，第2组不使用封口膜；3、4组在烧瓶中培养，第3组瓶盖始终都塞紧，第4组在培养第3周末松开瓶盖。观察不同时间点，不同条件对生物被膜形成的影响。

1.1 结核菌复苏

挑选36株生长良好的非耐药结核菌在罗氏培养基中复苏一遍。

1.2 结核菌二次培养

在复苏好的罗氏培养基中加入7H9 OADC培养液，放在摇床中培养1周。

1.3 接种前处理

将待处理菌株从培养箱中取出,经过两次离心后，加入苏通培养基，混匀，取1 ml,用分光光度计(600 nm)测OD 值。

1.4 接种

1.4.1 孔板中接种 把第1组及第2组的菌各提取3份，测好OD值；准备10个孔板(第1组5个，第2组5个)，取0.1OD值的结核菌加入孔中，通过稀释加入，每个孔板100 μl；在每一个含有结核菌的孔中加入苏通培养基约100 μl；第1组孔板缝隙处用封口膜包裹，第2组不使用封口膜；所有孔板放入温箱中，对比其发展过程。1.4.2 烧瓶中接种 把第3组及第4组的菌各提取1份，测好OD值；准备72个烧瓶，每个瓶中放入25 ml苏通培养基，再加入250 μl结核菌；拧紧每一个瓶盖；第3组瓶盖始终都塞紧，第4组在培养第3周末松开瓶盖；所有培养瓶放入温箱中，对比其发展过程。

2 结果

2.1 结核菌生物被膜体外培养条件

结核分枝杆菌生物被膜的成长，在培养第2周末可见生物被膜生长的痕迹，第5周末被膜生长成熟 (见图1)。

图1 结核分枝杆菌生物被膜5周的生长过程

2.2 使用封口膜覆盖孔板培养五周后，可见生物被膜的出现，而且生长良好(见图2)。2.3 未使用封口膜的孔板中，生物被膜的培养失败,所有孔板中未见结核分枝杆菌被膜形成(见图3)。

2.4 第3组生物膜生长良好，第4组生物膜长势较第3组弱，从所培养的孔板中可见在培养过程中，不断紧松瓶盖的孔板组生物被膜生长较持续关闭状态的孔板生长良好(见图4、5)。

图2 5周后生物被膜生长情况 图3 未使用封口膜的孔板中生物被膜生长情况 图4 第3组塞紧/松开瓶盖

2.5 培养过程中经常被晃动或查看的孔板及培养瓶中生物膜的生长要弱于其它培养皿中的生物膜。瓶中生物膜的生长要弱于其它培养皿中的生物膜。

3 讨论

细菌生物被膜是细菌吸附于生物材料或机体腔道表面，细菌分泌出多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等，并将细菌自身包裹其中形成的膜样物，是由多个细菌组成的一种膜状结构，是细菌为适应自然环境、有利于生存而特有的存在形式，具有结构和代谢的复杂性。生物被膜这种结构，能很好的帮助细菌抵制各种不良环境而使其更好的生存、生长和繁殖。结核菌在适合的条件下亦可形成生物膜，且因此出现抗药性。生物被膜一旦形成，对抗菌药物及机体免疫力有着天然的抵抗力，用抗菌药物就难以清除彻而且只能杀死生物被膜表面或血中导致感染发作的游离细菌。当机体抵抗力下降时，生物被膜中底，存活的细菌就又可以释放出来，重新引起感染。

图5 第4组拧紧瓶盖

目前对于金葡菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等生物膜的研究较深入。金葡菌生物膜培养时，需要振动培养，并且振动条件下进行培养的生物被膜的表面积显著高于静止培养的生物被膜的表面积。这个现象的主要原因是，静止培养的细菌附着后仍进行生长,分裂和繁殖,其它游离细菌继续附着,最终导致该附着位点的细菌生长环境比振动培养情况下还要拥挤,有毒的代谢物堆积,许多细菌得到的营养物质相对减少[5]。振动使细菌周围的毒素分散,更多营养物质提供附着点周围,从而为BF形成创造更有利的条件,使其表面积增大。而在低营养条件下,细菌嵌入在其自身分泌的细胞外基质中,使胞外基质合成分泌增加,导致BF形成弱,表面积小[6]。

然而结核菌BF在培养过程中经常被晃动或查看的孔板及培养瓶中生物膜的生长要弱于其它培养皿中的生物膜，这与金葡菌的生长条件明显不同，考虑与结核菌缓慢的生长方式有关。结核菌生长缓慢，不需要在短时间内获得大量的营养物质也能存活。

在烧瓶中培养结核菌BF时，需要在三周时松开瓶盖，这样可以提供更多的氧气，从而保证生物膜进一步的生长。这与结核菌好发于通气良好的肺尖组织是一致的。我们在气管结核患者的气道内，经常可以看到大量白色的膜样物质，需要反复的清除及局部注药方可能治愈，推测与生物膜的形成有相关性。

在孔板中培养生物膜时，使用封口膜是成功建立结核菌生物膜体外模型的关键，使用封口膜成功是因为其保证了结核菌生物膜生长环境的湿度以及减少了培养基的挥发，为生物膜的生长提供了良好的环境。

当前，在耐药结核愈演愈烈的状况下，加之近年来人类免疫缺陷病毒(HIV)与结核病双重感染率急剧上升，器官移植、免疫抑制剂应用及高龄患者感染结核的增多，寻找结核菌耐药机制，克服多重耐药菌是治疗肺结核成败的关键问题。细菌生物被膜广泛存在于自然界中，只要条件允许，任何细菌都可形成生物被膜，近来美国匹兹堡大学的研究人员发现结核分枝杆菌有非凡的抗药性，这种特性促使抗结核化疗的疗程长达6-9个月，但是这种抗药性的机制尚不明确。许多微生物为了抵抗环境的压力形成了生物膜，而结核菌亦存在生物膜。有生物膜的结核杆菌及耻垢分支杆菌，可承受超过50倍的最小抑菌浓度的抗结核药异烟肼和利福平。说明生物膜在结核菌的抗药性中发挥了重要的作用[7,8]。

由于生物被膜的特殊结构及特性，使得生物被膜内的细菌可对抗多数抗生素的杀菌作用，要阻止细菌生物被膜引起的感染，最有效的方法是阻止细菌生物被膜的形成，在生物被膜形成的前期就进行干预，就能起到事半功倍的作用。因此，如何清除细菌生物被膜成为近年来的研究热点。

[1]Costerton JW.Introduction to biofilm[J].Int J Antimicrob Agents,1999,11:217.

[2]Costerton JW,Stewart PS,Greenberg EP.Bacterial biofilms:a common cause of persistent in fections[J].Science,1999,284(5418):1318.

[3]Arweiler-Harbeck D,Sanders A,HeldM,et al.Does metal coating improve the durability of silicone voice prostheses[J]?Acta olaryngol,2001,121(5):643.

[4]Bjarnsholt T,Jensen P,Burmlle M,et al.Pseudomonas aeruginosa tolerance to tobramycin,hydrogen peroxide and polymorphonuclear leukocytes is quorum-sensing dependent[J].Microbiology,2005,151(Pt 2):373.

[5]Lin Xing,Huang Yunchao.Influence of on bacterial adherence and formation of bacterial biofilm to blomaterials[J].Biomedical Engineering Foreign Medical Sciences,2005,(5):290.

[6]Tsai YP,Pai TY,Qiu JM.The impacts of the AOC concentration on biofilm formation under higher shear force condition[J].J Biotechnol，2004，111(2):155.

[7]Ojha,A,Anand M,Bhatt A,et al.GroEL1:a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria[J].Cell,2005,123(5),861.

[8]Ojha AK,Trivelli X,Guerardel Y,et al.Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms[J].J Biol Chem,2010,285(23):17380.

Mycobacterium tuberculosis biofilm in vitro model

HOUZhi-li,YEJing,MEIZao-xian,etal.

(TianJinHaiHeHospital,TianJinInstituteofRespiratoryDiseases,Tianjin300350，China)

Objective This study to explore how to establish model of tuberculosis bacterium biofilm in vitro.Methods Select the non-drug-resistant TB bacteria and resuscitate them in Roche solid culture medium.Then culture then for one week in the 7H9 OADC medium in order to reach the same activity.Culture the TB bacteria in screw capped bottle and orifice plate with Sauton's media.Results In orifice plate,we successfully obtained biolfilm for all bacterial when used sealing film.In screw capped bottle,we need to tight the cap until the end of the third week and loose the cap at the end of the third week.We can observed the biofilm at the end of the second week and found the structure matured by the end of the fifth week.Conclusion TB biofilm can be successfully cultured in vitro.

Bacterial biofilm；Mycobacterium tuberculosis

天津市卫生局资助课题(2010KR08)

1007-4287(2017)04-0686-03

R378.91+1

A

2016-04-20)

*通讯作者