马碧峰，罗永祥，李林

（湖南圣雅凯生物科技有限公司，湖南湘潭411228）

试验研究

一种快速测定硫酸黏杆菌素注射液含量的方法

马碧峰，罗永祥，李林

（湖南圣雅凯生物科技有限公司，湖南湘潭411228）

［目的］为建立快速测定硫酸黏菌素注射液中粘菌素含量的方法。［方法］利用紫外-可见分光光度计法，以多粘菌素为对照品，在碱性环境下，能够与硫酸铜发生络合反应生成紫红色的络合物，最大吸收波长为560nm。取10mL样品供试液于25mL容量瓶中，加入2mL氢氧化钠溶液和1mL硫酸铜溶液，并加水定容至刻度，30℃保温15min后过滤，以纯水为空白在560nm波长下进行测定。［结果］粘菌素回归方程为y=0.0085x+0.0184，R2=0.9953，线性范围为20mg～80mg，加标回收率为（n=6）100.0%。［结论］该方法测定准确，操作简单，适用于规模化工业生产硫酸黏杆菌素注射液的快速测定，提高企业效率。

快速测定；硫酸粘菌素；紫外-分光光度法

硫酸黏菌素为白色至微黄色粉末，无臭或几乎无臭、有引湿性，易溶于水，微溶于乙醇，几乎不溶于三氯甲烷或乙醚[1]。硫酸黏杆菌素是由多粘杆菌产生，对革兰氏阴性菌有较强抗菌作用，用于治疗革兰氏阴性菌引起的肠道疾病，用作饲料添加剂，且有明显促生长作用[2]。农业部已于2016年11月1日起禁止将硫酸粘菌素用作饲料添加剂[3]，硫酸黏菌素注射液将成日后使用的主要形式。硫酸粘菌素在2015版兽药典中规定依旧采用抗生素微生物检定法进行测定，但生物效价法测定历时较长，且操作十分复杂，在企业规模生产安排中属于明显短板环节，而利用紫外-可见分光光度法[4]能够高效率快速测定硫酸粘菌素的含量[5]，方法简便，操作简单，用时较短，可应用于企业规模生产中，提升企业效率。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

新制纯化水，3mol/L氢氧化钠溶液（分析纯，西陇化工股份有限公司），5%硫酸铜溶液（分析纯，广东光华科技股份有限公司），硫酸黏杆菌素注射液（规格5mL：0.1g，湖南圣雅凯生物科技有限公司），粘菌素标准品（批号30327-200305，中国药品生物检定所，每mg含22106单位）。

标准溶液：精确称取粘杆菌素标准品400.0 mg，用纯水于100 mL容量瓶中溶解并定容至刻度。

100 mL容量瓶，25 mL容量瓶，10 mL容量瓶，常用体积刻度吸管，电子天平（岛津AUW-220D），水浴锅（北京永光明DZKW-S-4），紫外-可见分光光度计（岛津UV-1800）。

1.2 标准曲线的制备

精密吸取 5.0 mL、7.5 mL、10.0 mL、12.5 mL、15.0 mL以及20.0 mL标准溶液于25 mL棕色容量瓶中，并按顺序加入3mol/L的氢氧化钠溶液2mL和5%的硫酸铜溶液1 mL，边加边振摇，用纯水稀释至刻度，摇匀，将容量瓶置于30℃水浴中15 min，之后过滤，取续滤液，在560nm波长处测定吸光度，以该处吸光度A对粘菌素标准品质量（m，mg）线性归回方程。

1.3 样品的测定

精密吸取5.0mL硫酸黏杆菌素注射液样品于25mL容量瓶中，用水稀释至刻度，作为供试样品液。

精密吸取10.0 mL供试样品液于25 mL容量瓶中，按顺序加入3 mol/L的氢氧化钠溶液2 mL和5%的硫酸铜溶液1 mL，边加边振摇，用纯水稀释至刻度，摇匀，将容量瓶置于30℃水浴中15 min，之后过滤，取续滤液，在560 nm波长处测定吸光度，将测得的吸光度代入标准曲线线性回归方程，求得硫酸黏杆菌素注射液中粘菌素的含量。

2 结果与分析

2.1 测定波长的确定

多粘菌素是一种多肽类抗生素，能与双缩脲试剂发生反应显色，双缩脲反应产生的紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。取一定量粘菌素用纯水溶解，以纯水为空白对含硫酸粘菌素溶液和不含硫酸粘菌素溶液使用氢氧化钠和硫酸铜溶液进行处理，并用紫外-可见分光光度计在一定波长内进行扫描，经查看分析确定最终测定波长为560 nm。

2.2 氢氧化钠溶液和硫酸铜溶液的正交实验

分别精密吸取一定量标准曲线制备液于25mL容量瓶中，按顺序加入氢氧化钠溶液和硫酸铜溶液，氢氧化钠溶液浓度为1 mol/L、2 mol/L和3 mol/L，硫酸铜溶液浓度为1%、3%和5%，进行正交实验，由结果可得在加入3 mol/L氢氧化钠溶液2 mL以及5%硫酸铜溶液1mL时该处吸光度有最大值，正交实验结果如表1和表2所示。

表1 氢氧化钠溶液和硫酸铜溶液的正交实验结果

表2 氢氧化钠溶液和5%硫酸铜溶液的正交实验结果

2.3 温度的选择

精密吸取10.0 mL标准曲线制备液于25 mL容量瓶中，按顺序加入2 mL的氢氧化钠溶液和1 mL硫酸铜溶液，并用纯水定容至刻度。分别在10～50℃水浴保温15 min进行对比实验，结果如表3所示。

表3 温度选择实验

由表3可知，在水浴温度30℃时，本实验在560nm波长处测得的吸光度值最大，因此选定30℃作为实验的反应温度。

2.4 稳定性考察

精密量取10.0 mL标准曲线制备液于25 mL容量瓶中，加入3 mol/L的氢氧化钠溶液2 mL和5%的硫酸铜溶液1 mL，边加边振摇，用纯水稀释至刻度，摇匀，将容量瓶置于30℃水浴中15 min，之后滤过，取续滤液，在560 nm波长处测定吸光度，每10min测定一次，结果如表4所示。

表4 实验稳定性考察

由表4可知，在反应结束后的30min之内，溶液性质基本保持稳定，测定结果变化小，整体来看略有下降的趋势，但变化甚微，基于对最佳结果的考虑，应于反应完成后，尽快进行测定。

2.5 标准曲线

按照实验方法做吸光度A对多黏菌素质量（m，mg）线性回归方程，结果如表5所示。

表5 标准溶液吸光度值

由表5得到线性回归方程y=0.0085x+0.0184，相关系数 R2=0.9953，表明粘菌素在供试质量20mg～80mg的范围内线性良好。

2.6 测定方法准确度验证

精确吸取12.5mL多粘菌素标准曲线制备液于已量取5.0mL供试品的25mL容量瓶中，用纯水定容至刻度。准确吸取10mL该溶液加入供试液中，按确定试验条件进行回收实验，方法的平均回收率（n=6）为100.0%，加标回收实验吸光度测定结果如表6所示。

表6 准确度测定实验吸光度值

3 结论

实验结果表明，该快速测定方法待测物质标准品线性符合要求，实验准确度符合要求，经笔者多次重复实验，每次对应标准品含量测定吸光度值变化较小，方法重现性较好，说明用紫外-分光光度法测定硫酸粘杆菌素注射液的含量方法可行，实际生产过程中测定实验时，可以采取单点外标法进行定量。该方法能够适用于规模化生产硫酸黏杆菌素注射液中间环节的快速检测中，提高企业效率。□

[1]中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典[M].1部.北京：中国农业出版社，2015.

[2]李德培.抗革兰氏阴性菌促长药物——粘杆菌素[J].兽药与饲料添加剂，1999，4（1）：21-24.

[3]农业部（2428号）.中华人民共和国农业部公告2428号[S].

[4]中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典[M].1部.北京：中国农业出版社，2015.

[5]石晓光，丁瑜，周晓红，等.紫外-可见分光光度法快速测定硫酸粘杆菌素E[J].吉林化工学院学报，2011，28（5）：41-42.

S859.79

A

1006-4907（2017）02-0033-02

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.02.015

2017-03-15