左松 张炯

·实验研究·

表没食子儿茶素没食子酸酯对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用

左松 张炯

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及作用机制。方法 将50只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和EGCG(低，中，高)剂量组，每组10只。利用血管夹夹闭大鼠双侧肾蒂45 min，构建大鼠肾缺血再灌注损伤模型。恢复肾脏血流灌注24 h后，处死大鼠，收集血清。利用ELISA法检测血清肌酐(SCr)、血清尿素氮(BUN)、干扰素(interferon-γ, IFN-γ)、肿瘤坏死因子(tumor meerosis factor-α, TNF-α)和白介素6(interleukin- 6, IL-6)表达水平；取肾脏标本PAS染色法观察肾组织病理形态；黄嘌呤氧化酶法检测过氧化氢酶(Cata-lase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性；硫代巴比妥酸法检测丙二醛(malonaldehyde, MDA)的含量；免疫蛋白印记(Western blotting) 法检测p53、Wnt、p21和β-catenin表达水平；实时定量PSCR(RT-PSCR)检测肾脏IFN-γ、TNF-α和IL-6含量。结果 与假手术组相比，模型组SCr、BUN、IFN-γ、TNF-α、 IL-6、 MDA、p53、Wnt、p21、β-catenin、IFN-γ、TNF-α和IL-6 表达水平以及肾组织病理改变均明显增高，而CAT,GPx 和SOD活性明显降低。与模型组相比， EGCG高剂量组SCr、BUN、IFN-γ、TNF-α、 IL-6、 MDA、p53、Wnt、p21、β-catenin、IFN-γ、TNF-α和IL-6 表达水平以及肾组织病理改变均明显降低，而CAT,GPX和SOD活性明显增高。结论 EGCG预处理可通过抑制炎症和氧化应激而减轻肾脏缺血再灌注损伤，其作用机制与抑制Wnt/β-catenin/p53信号通路激活相关。

表没食子儿茶素没食子酸酯；肾缺血再灌注损伤；炎症；氧化应激

肾脏缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)是临床上常见的危重病理生理过程，常见于肾动脉血流阻断、肾移植和低休克等危重情况, 可导致急性肾损伤或移植肾术后功能恢复延迟。如何预防IRI是一个亟待解决的重大临床问题[1-4]。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是提取于绿茶的主要活性成分，可有效清除氧自由基和调节免疫[5-6]。近年来，研究还发现EGCG对肠、脑、心脏等器官缺血损伤有保护作用[7-9]。因此本实验通过建立大鼠肾脏IRI模型[1-4],探讨EGCG对肾脏IRI的保护作用及其机制。

材料与方法

一、材料

1.实验试剂与仪器 EGCG(美国Sigma公司,批号20140726)，水合氯醛(谷歌生物，批号MB1699)；Wnt (美国CST公司,批号13808), β-catenin (美国CST公司,批号1002)，p53(美国CST公司,批号8357),p21(CST，USA, 9867), TRIzol reagent (美国Invitrogen公司,批号15596-026), 逆转录试剂盒(美国GeneCopoeia公司,批号K1622)，PAS试剂(宜宾市第一人民医院肾内科病理实验室)。紫外分光光度计(Thermo fisher)，RT-PSCR仪(BIO-RAD IQ5)，逆转录仪(eppendorf)，显微镜(Olympus BX51)及成像系统(HITMAS-30)。

2.实验动物 50只雄性SD大鼠，体质量(220±25) g，购自重庆医科大学实验动物中心，SPF级，饲养于标准环境,12 h光照周期，适应性喂养1周。

二、实验分组

将50只SD大鼠分为假手术组、模型组和EGCG低、中、高剂量组。EGCG低、中、高剂量组术前45 min分别给予EGCG 10、20、40 mg/kg腹腔注射，假手术组和模型组则给予等量生理盐水腹腔注射。模型组和EGCG低、中、高剂量组制备大鼠肾脏IRI模型。具体IRI模型制备方式参考文献[10]：大鼠术前禁食不禁水12 h，用3.5%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉，腹部备皮，碘伏消毒后，腹部正中切口暴露双侧肾脏，钝性分离双侧肾动脉，保护输尿管，距肾门0.5 cm处用无创动脉夹夹闭双侧肾动脉，夹闭45 min后松开动脉夹恢复灌注，肾脏由暗红色恢复红润表明再灌注成功，然后逐层缝合切口。假手术组只暴露双侧肾蒂(不夹闭)，暴露45 min后再关闭切口。大鼠麻醉清醒后转入代谢笼内自由进水及进食,恢复肾脏血流灌注24 h后处死大鼠，摘除大鼠右肾并收集血清。

三、方法

1.肾脏病理检查 取肾脏标本，多聚甲醛固定,脱水浸蜡,石蜡包埋,4 μm切片, 行PAS染色, 光镜下观察形态结构，在病变严重处采用Paller法对肾小管损伤程度评分，即每高倍镜视野(PH)随机选择(10)个有病变的肾小管，按(100)个肾小管记分：肾小管明显扩张、细胞扁平计1分；刷状缘损伤计1分，脱落计2分；管型计2分，肾小管管腔内有脱落的、坏死的细胞(未成管型或细胞碎片)计1分，评分标准参考相关文献[11]。

2.Western检测蛋白表达 按说明书方法提取各组肾脏细胞总蛋白，定量，变性，上样，电泳, 转膜, 封闭，孵一抗Wnt (1∶1 000), β-catenin (1∶500)，p53 (1∶500), p21(1∶500)和β-actin(1∶4 000)，洗膜, 孵二抗IgG( 1∶400)、洗膜，显影，分析，具体方法参考说明书。

3.PSCR检测 取肾脏组织细胞，研磨，提取总RNA，检测RNA含量，反转录，上样检测。PSCR以β-actin为内参, 具体方法参考文献[6]，引物序列如表1所示，扩增条件为：95 ℃(10 min)→95 ℃(10 s)→60 ℃(1 min)×40个循环，利用图像分析仪器上进行扫描分析，将白介素-6(interleukin-6, IL-6), 肿瘤坏死因子(tumor meerosis factor-α, TNF-α)和干扰素(interferon-γ, IFN-γ)基因扩增产物的密度与β-actin基因扩增产物的密度之比作为基因表达值。

4.ELISA检测血清中的相关指标 收集各组大鼠血清，按照ELISA试剂盒说明书操作步骤检测SCr、BUN、IL-6、TNF-α、IFN-γ细胞因子在血清中表达水平。

表1 RT-PSCR引物序列

5.肾组织测定 黄嘌呤氧化酶法检测肾黄嘌呤氧化酶法检测过氧化氢酶(Cata-lase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性;用硫代巴比妥酸法检测肾脏硫代巴比妥酸法检测丙二醛(malonaldehyde, MDA)含量,具体操作参看说明书。

四、统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行分析，实验结果用均数±标准差表示，资料采用单因素方差分析(ANOVA)，多个样本之间的两两比较采用T检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、肾功能变化

与假手术组相比, 模型组血清SCr和BUN水平均明显升高(P<0.05), 提示IRI可致大鼠肾功能严重受损。与模型组相比, EGCG低、中、高剂量组血清SCr和BUN水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；且随着EGCG浓度的的升高，血清SCr和BUN水平是依次下降的，差异有统计学意义(P<0.05)。提示EGCG在10～40 mg/kg范围内，为大鼠肾脏提供最佳保护效果的浓度为40 mg/kg。(表2)

表2 EGCG预处理对肾缺血再灌注损伤的影响

注：与假手术组相比，aP<0.05；与模型组相比,bP<0.05

二、EGCG对各组肾组织病理结构的影响

与假手术组相比，模型组肾小管上皮细胞明显肿胀, 大量刷状缘脱落，肾小管囊状扩张空泡变性和坏死,其损伤评分为(3±1)分，而假手术组为(0.3±0.2)分，提示IRI可导致肾脏病理结构明显改变。与模型组相比, EGCG高剂量组肾小管上皮细胞肿胀, 刷状缘脱落，肾小管囊状扩张，空泡变性和坏死明显减少，其损伤评分(2±0.5)分，与模型组相比明显减轻(P<0.05)。结果提示，最佳浓度EGCG(40 mg/kg)预处理可明显减轻肾脏病理结构改变。(图1)

三、EGCG对各组信号通路的影响

与假手术组相比，模型组Wnt、β-catenin、p53和p21表达明显增高(P<0.05)。而EGCG高剂量组和模型组相比，Wnt、β-catenin、p53和p21表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。(图2)

四、EGCG对促炎症细胞因子表达影响

与假手术组相比，模型组TNF-α, IFN-γ 和IL-6水平均明显增高(P<0.05)；EGCG高剂量组与模型组相比, TNF-α, IFN-γ和 IL-6 表达水平均明显降低(P<0.05)。(图3)

五、EGCG对各组MDA含量的影响

TBA检测显示假手术组MDA含量(100±20) ng/L，模型组MDA含量(2 400±200) ng/L，2组相比有统计学差异(P<0.05)；EGCG高剂量组MDA含量(850±120) ng/L，与模型组相比，MDA含量明显降低(P<0.05)。

六、EGCG对各组CAT、 GPx和SOD活性的影响。

与假手术组相比, 模型组CAT、GPx和SOD活性明显降低(P<0.05)，但EGCG高剂量组与模型组相比，CAT、GPx和SOD的活性明显增高(P<0.05) 。(图4)。

图1 PAS染色检测EGCG对肾脏病理结构的影响(4×100)

注:假手术组相比,aP<0.05;与模型组相比,bP<0.05;A为假手术组,B为模型组,C为EGCG高剂量组图2 WB检测EGCG预处理对Wnt,β-catenin,p53和p21蛋白表达的影响

注:假手术组相比,aP<0.05;与模型组相比,bP<0.05;A为假手术组,B为模型组,C为EGCG高剂量组图3 EGCG对促炎症细胞因子表达影响

讨 论

IRI是器官或组织血供中断，重新器官或组织血供，导致器官与组织损伤进一步加重的临床危象。肾脏作为高灌注血流器官之一，对缺血或缺血再灌注损伤尤其敏感。因此如何防治IRI是一个亟待解决的重大临床问题，既往研究IRI涉及炎症、凋亡和氧化应激等[1-3]。本研究结果显示IRI可导致促炎症细胞因子TNF-α、IL-6和IFN-γ表达以及促氧化应激产物MDA含量明显增高，而抗氧化应激产物CAT、GPx和SOD活性明显降低，进一步证实了炎症和氧化应激是IRI密切相关[1-3]，抑制炎症和氧化应激是减轻IRI的有效途径。

注:假手术组相比,aP<0.05;与模型组,与EGCG组相比,bP<0.05;A为假手术组,B为模型组,C为EGCG高剂量组图4 黄嘌呤氧化酶法检测EGCG对肾组织CAT,GPx和SOD活性影响

天然植物是一个巨大的药学宝库，尤其是表没食子儿茶素没食子酸酯，研究发现其具有抗凋亡、抑制炎症和清除氧自由基等多种生物学活性[7-9]，可通过抗凋亡减轻肾缺血再灌注损伤[10]，但对炎症和氧化应激是否有影响尚不清楚。本研究结果显示EGCG预处理可明显减少SCr、BUN、TNF-α、IL-6、IFN-γ和MDA的表达，增加CAT、GPx、SOD活性，以及明显减少肾脏病理改变，这提示EGCG对肾脏IRI的保护作用与抑制炎症和氧化应激相关。

肿瘤抑制蛋白p53是一重要的信号通路转导蛋白，可介导炎症、凋亡、氧化应激等反应，p21是其激活的定向靶向产物[11-12]，而p53蛋白的激活可受Wnt/β-catenin信号通路调节[13-14]。本研究结果显示IRI可增加Wnt、β-catenin、p53、p21的表达，而EGCG预处理可明显减少Wnt、β-catenin、p53、p21的表达。因既往有研究显示抑制Wnt/β-catenin信号通路可减轻IRI[15]，因此本研究未用Wnt拮抗剂验证阻断Wnt/β-catenin信号通路能否减轻IRI，这将是接下来进一步研究的重点。

综上所述，EGCG可通过抗炎和抑制氧化应激而减轻肾脏缺血再灌注损伤。其作用机制与抑制Wnt/β-catenin/p53 信号通路相关，但是否还有其他通路涉及其中，尚需进一步研究。

[1] Shen H, Kreisel D, Goldstein DR. Processes of sterile inflammation[J]. J Immunol, 2013, 191(6): 2857-2863.

[2] Kalyanaraman B. Teaching the basics of redox biology to medical and graduate students: Oxidants, antioxidants and disease mechanisms[J]. Redox biology, 2013, 1(1): 244-257.

[3] Kusch A, Hoff U, Bubalo G, et al. Novel signalling mechanisms and targets in renal ischaemia and reperfusion injury[J]. Acta Physiol (Oxf), 2013, 208(1): 25-40.

[4] Wang Y, He J, Pei X, et al. Systematic review and meta-analysis of mesenchymal stem/stromal cells therapy for impaired renal function in small animal models [J]. Nephrology, 2013, 18(3): 201-208.

[5] Pae M, Wu D. Immunomodulating effects of epigallocatechin-3-gallate from green tea: mechanisms and applications [J]. Food Funct, 2013, 4(9): 1287-1303.

[6] Camfield DA, Stough C, Farrimond J, et al. Acute effects of tea constituents L-theanine, caffeine, and epigallocatechin gallate on cognitive function and mood: a systematic review and meta-analysis[J]. Nutr Rev, 2014, 72(8): 507-522.

[7] Akizawa Y, Kitazato T, Kishimoto H, et al. Effects of antioxidants on drug absorption in in vivo intestinal ischemia/reperfusion [J]. Eur J Drug Metab Pharmacokinet, 2011, 35(3-4): 89-95.

[8] Zhang F, Li N, Jiang L, et al. Neuroprotective Effects of (-)-Epigallocatechin-3-Gallate against Focal Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury in Rats Through Attenuation of Inflammation[J]. Neurochem Res, 2015, 40(8): 1691-1698.

[9] Lee SK, Kim JH, Kim JS, et al. Polyphenol (-)-epigallocatechin gallate-induced cardioprotection may attenuate ischemia-reperfusion injury through adenosine receptor activation: a preliminary study[J]. Korean J Anesthesiol, 2012, 63(4): 340-345.

[10]Lv J, Feng M, Zhang L, et al. Protective effect of epigallocatechin gallate, a major constituent of green tea, against renal ischemia-reperfusion injury in rats[J]. Int Urol Nephrol, 2015, 47(8): 1429-1435.

[11]董文斌, 冉隆瑞, 冯志强, 等. 白细胞参与新生鼠窒息后肾损伤的作用及机制研究[J]. 中国危重病急救医学, 2000, 12(4): 208-210.

[12]Vaseva AV, Moll UM. The mitochondrial p53 pathway [J]. Biochim Biophys Acta, 2009, 1787(5): 414-420.

[13]Miura T, Nishihara M, Miki T. Drug development targeting the glycogen synthase kinase-3beta (GSK-3beta)-mediated signal transduction pathway: role of GSK-3beta in myocardial protection against ischemia/reperfusion injury[J]. J Pharmacol Sci, 2009, 109(2): 162-167.

[14]Xia Y, He Z, Liu B, et al. Downregulation of Meg3 enhances cisplatin resistance of lung cancer cells through activation of theWNT/β-catenin signaling pathway[J]. Mol Med Rep, 2015, 12(3): 4530-4537.

[15]Zhou D, Li Y, Lin L, et al. Tubule-specific ablation of endogenous β-catenin aggravates acute kidney injury in mice[J]. Kidney Int, 2012, 82(5): 537-547.

Protective effect of EGCG on renal ischemia-reperfusion injury

ZUOSong,ZHANGJiong.

DepartmentofNephrology,YibinFirstPeople’sHospital,Yibin644000,China

ZHANGJiong,E-mail: 774067870@qq.com

Objective To explore the protective effects of EGCG on renal ischemia-reperfusion injury (IRI) and the mechanism.Methods Male SD rats were randomly divided into Sham, IRI and EGCG (low, middle and high dose) groups. The model of IRI was induced by clamping the bilateralrenal pedicles for 45min and removing right kidney, successive reperfusion for 24 h. The levels of SCr, BUN, IFN-γ, TNF-αand IL-6 in the serum were examined by ELISA. The expression levels of Wnt, β-catenin, p53 and p21 were detected by Western blotting. The expression of MDA was measured by TBA. Moreover, the morphrologic changes of kidney and the activation of CAT, GPX and SOD in the kidney were measured by PAS and hydrogen peroxide enzyme, respectively.Results Compared to Sham group, the levels of SCr, BUN, IFN-γ, TNF-α, IL-6, Wnt, β-catenin, p53, p21 and MDA were significantly increased, the pathological changes of the kidney significantly aggravated and activities of CAT, GPx and SOD significantly reduced in the kidney in the IRI group. Compared to IRI group, the levels of SCr, BUN, IFN-γ, TNF-α, IL-6, Wnt, β-catenin, p53, p21 and MDA were significantly reduced, pathological changes of the kidney alleviated and activities of CAT, GPXand SOD in the kidney increased in the EGCG group.Conclusions EGCG preconditioning can reduce kidney IRI by suppressing inflammation and oxidative stress in rats, which may be associated with the inhibition of Wnt/β-catenin/p53 signal pathway activation.

Epigallocatechin gallate; Kidney ischemia reperfusion injury; Inflammation; Oxidative stress

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.04.010

国家自然科学基金资助(No.81500575)

644000 宜宾，宜宾市第一人民医院肾内科(左松)；610000 成都，四川省人民医院肾内科(张炯)

张炯，E-mail: 774067870@qq.com

2016-11-23

2017-02-05)