铜绿假单胞菌SU8发酵液与乙蒜素混配对草莓灰霉病的防效

2017-05-11楚文琢彭双强廖晓兰马文月

江苏农业科学 2017年6期

楚文琢+彭双强++廖晓兰+马文月

摘要：用拮抗细菌铜绿假单胞菌SU8的发酵液和乙蒜素乳油进行混配以期达到有效防治草莓灰霉病的目的，分别从SU8发酵液与乙蒜素乳油混配的室内毒力、孢子萌发抑制率和盆栽防效试验等3个方面进行研究。结果表明，SU8发酵液对草莓灰霉病菌的最小抑菌浓度（MIC）为12.50 mg/L，EC50为1 696.4 mg/L，乙蒜素乳油对草霉灰霉病菌的MIC为6.25 mg/L，EC50为143.4 mg/L；当两者以质量比1 ∶9混配时，增效系数为1.04，表现为协同作用，当两者分别以质量比1 ∶4、1 ∶1、4：1、9 ∶1混配时，增效系数分别达到了1.53、2.33、5.41、8.41，均表现出明显的增效作用；在对病菌孢子萌发抑制方面，在12、24、36 h内，乙蒜素乳油的抑制率分别为60.9%、58.4%、47.0%，低于两者质量比 4 ∶1 、 9 ∶1 混合组配；在盆载试验中，乙蒜素乳油的防病效果也比两者质量比4 ∶1、9 ∶1混合组配低。由结果可知，与SU8发酵液混配，能极显著增强乙蒜素对草莓灰霉病的防治效果。

关键词：SU8发酵液；乙蒜素乳油；混配；增效作用；草霉灰霉病菌；防治

中图分类号： S436.68+4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）06-0079-04

草莓灰霉病（Botrytis cinerea）是影响我国草莓生产的一种常见病害，其病原菌属灰葡萄孢菌，为腐生致病菌，可以侵染番茄、茄子、黄瓜、西葫芦、草莓、葡萄、苹果、菜豆等多种作物[1-3]。该病菌感染植株后，若不能得到有效控制，一般情况下会致使草莓减产10%～20%，严重时往往导致草莓植株叶片干枯、果实出现斑点或腐烂，甚至整株死亡，减产率高达70%～80%[4-5]，严重影响草莓的产量与质量，造成重大经济损失。目前，农业生产上对灰霉病的防治主要依赖多菌灵、腐霉利等化学药剂[6-9]。然而，这些化学药剂在取得较好防治效果的同时，由于灰霉病菌具有寄主范围广、繁殖速度快、遗传变异性大和适应性强的特点，极易产生抗药性，并且在化学药剂的长期使用过程中，其抗药性也不断增强[10-18]，这些特性使得化学药剂对草莓灰霉病的防治效果下降很快[19-22]。因此，在生产过程中，为了增强对灰霉病的防治效果，往往采用增大剂量或者增加施药次数的措施，这种措施可能会导致草莓本身药剂残留量超标，最终危及人畜健康，影响我国草莓生产与出口，非常不利于我国当前绿色农业和生态农业的发展要求[23]。尤其是我国加入世界贸易组织（WTO）后，世界对我国农副产品出口提出了更高的要求。因此，我国的草莓种植业迫切需要一些符合我国农业发展的新型途径来有效控制灰霉病的发生与蔓延。

生物防治具有低污染、低残留、低成本的特点，正逐渐成为灰霉病控制中一条重要有效的途径[24-25]。近几十年来，国内外专家进行了大量研究，筛选出具有抑制灰霉病菌的拮抗细菌，发现当前常见的灰霉病拮抗菌株主要为木霉、酵母菌、芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和放线菌等[26-29]。然而，大量报道也表明，单一的生物防治因菌株具有极大的变异性而导致防治效果不稳定。研究也发现，将拮抗细菌与化学药剂混配对延缓病原菌的抗药性、提高药剂对病原菌的防治效果有一定的作用。例如，周荣金等将不同的拮抗细菌混配能有效提高对灰霉病的防效，对灰霉病的防治具有显著增效作用[30]；张红娟等从核桃上分离得到的2株内生菌HT3与HT5分别与速克灵药剂混配能有效增强对灰霉病菌的抑制作用[31]。但目前利用拮抗细菌发酵液和植物源杀菌剂混配来防治草莓灰霉病的报道罕见。笔者所在实验室从稻鸭共养田中分离出1株对水稻纹枯病菌（Rhizoctoria solani）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、烟草赤星病菌（Alternaria alternata）等多种真菌具有较强拮抗效果的铜绿假单胞菌SU8，研究发现其发酵液乙酸乙酯提取物也有同样的抑菌效果[32]。此外，有研究表明，大蒜提取物对草莓灰霉病菌有较好的抑制效果，并且农业生产中以大蒜提取物为原料合成的仿生农药——乙蒜素乳油对包括草莓灰霉病在内的多种病害均具有显著防治效果[33-34]。基于此，本研究拟用乙蒜素乳油和SU8发酵液混配来开展试验，以期拓宽对该病的防治途径，为防治草莓灰霉病提供新思路。

1材料与方法

1.1试验材料

供试菌株为由湖南农业大学植物保护学院植物病理学实验室筛选分离的SU8拮抗细菌和草莓灰霉病菌。供试药剂为80%乙蒜素乳油（北京中农佳瑞有限公司）。试验植株为易感灰霉病品种丰香。

供试培养基：（1）PDA培养基，200 g马铃薯、15 g葡萄糖、17 g琼脂，pH值自然；（2）马铃薯葡萄糖培养液：除不加琼脂外，其余同PDA培养基；（3）NA培养基：10 g牛肉浸膏、10 g蛋白胨、5 g氯化钠、17 g琼脂，pH值为7.0～7.2；（4）NB培养液：除不加琼脂外，其余同NA培养基。上述培养基均加水定容至1 L，于1.01×106 Pa、121 ℃灭菌20 min，备用。

1.2试验方法

1.2.1拮抗菌SU8发酵液的制备将拮抗菌SU8在NA培养基上活化后，用接种环取1环于10 mL无菌水中搅拌均匀，做成菌体悬浮液。取NB培養液与10% 上述SU8菌体悬浮液于摇瓶中，在磁力搅拌机上，28 ℃、220 r/min振荡连续培养120 h，得到SU8发酵液。

取适量发酵液，用旋转蒸发仪于100 r/min、60 ℃恒温条件下浓缩至原来体积的1/10。再将10倍浓缩液在4 ℃、10 000 r/min 条件下离心20 min，取上层液体，得到SU8发酵液粗滤液。用细菌过滤器（0.22 μm）逐步过滤除菌后的无菌发酵液，即为SU8发酵液（浓度视为 1 g/mL，以下简称SU8发酵液），置于4 ℃，保存备用。

1.2.2拮抗效果与拮抗活性的测定（1）SU8菌对草莓灰霉病菌的拮抗效果。试验采用对峙培养法：在无菌工作台上，用融化的PDA培养基制作成直径为7 cm的PDA平板。用SU8菌体悬浮液将灭过菌的滤纸片（直径为0.5 cm）润湿，置于PDA平板的一侧。同时，在PDA平板的另一侧对称性地放置1个直径为0.5 cm的草莓灰霉病菌菌饼，25 ℃培养箱中连续培养72 h。观察草莓灰霉病菌菌落生长情况并测定抑菌带宽度，每个处理3次重复。

（2）SU8发酵液和乙蒜素乳油对草莓灰霉病菌的拮抗活性测定。取草莓灰霉病菌菌饼（直径为0.5 cm）接种于PDA平板的中央，25 ℃下培养24 h后在新长出的菌丝两侧对称打孔（直径为0.5 cm）。挑出孔内基质后，在其中的1个孔内加入适量的SU8发酵液（浓度为1 g/mL），在对称的另1个孔内加入等量的无菌水作对照。乙蒜素乳油（无菌水稀释100倍，浓度视为1 g/mL，下同）作相同的处理。25 ℃培养72 h后，观察草莓灰霉病菌菌落生长情况并测定抑菌带宽度，每个处理3次重复。

1.2.3室内毒力测定（1）最小抑菌浓度（MIC）测定。参照黄彰新菌丝生长速率法[35]进行MIC测定并稍作修改。其具体操作如下：在无菌工作台上，用无菌水分别将SU8发酵液和乙蒜素乳油配制成1 000.0、750.0、500.0、250.0、125.0、62.5 mg/L的6种不同浓度，4 ℃下保存备用。在9.0 mL热培养基中，分别加入1.0 mL不同浓度的2种物质，以加1 mL水为对照，摇匀制成平板；接种同时活化的灰霉病菌菌饼（直径0.5 cm），使带菌丝的一面贴在培养基表面，置于25 ℃的培养箱中恒温培养。待对照菌丝长至培养皿的2/3面积时，用十字相乘法测定菌落直径，每个处理3次重复。以不长菌处理药剂的最低浓度为最小抑菌浓度。

（2）菌丝生长抑制率的测定。在最小抑菌浓度的基础上，分别取相应浓度的SU8发酵液与乙蒜素乳油以质量比 1 ∶9、1 ∶4、1 ∶1、4 ∶1、9 ∶1进行混配，每个混合组配配制5种不同的梯度浓度，置于4 ℃保存备用。参照菌丝生长速率法计算药剂的菌丝生长抑制率，每个处理3次重复。通过公式计算药剂对菌丝生长的抑制率，并采用Wadley的增效比率法[36]计算2种物质的毒力回归方程和混合组配的增效系数，相应公式：

相对抑制率= 对照菌落直径-处理菌落直径1对照菌落直径-菌饼直径×100%；

混剂的理论EC（th）50=a+b1（a/A的EC50+b/B的EC50）；

增效系数（SR） = 混剂的EC（th）501混剂的EC50。

式中：菌落生长直径为测量直径减去0.5 cm的菌饼直径，cm；A为SU8发酵液；B为80%乙蒜素乳油；a、b分别为SU8发酵液、80%乙蒜素乳油在混合组配物总质量中的比例，%。

根据增效系数（SR）进行联合作用综合评价。当0.5

1.2.4孢子萌发抑制活性的测定采用孢子萌发法[37]测定孢子萌发抑制活性。在无菌条件下，分别配制浓度为 500 mg/L 乙蒜素乳油、浓度为2 000 mg/L SU8发酵液，再取适量SU8发酵液和乙蒜素乳油按质量比4 ∶1、9 ∶1进行混配，得到混合组配，置于4 ℃保存备用。将病原菌培养8 d，待其产孢后，加无菌水 5 mL，在培养基表面用接种针轻轻摩擦，使病原菌孢子悬浮于水中，将培养基块和菌丝体用纱布过滤，制成2万个/mL的孢子悬浮液。分别取各药剂与孢子悬浮液等体积充分混合，以无菌水作空白对照滴加在洁净的凹玻片上。在25 ℃恒温条件下培养，分别培养12、24、36 h后，在40倍物镜下镜检孢子萌发情况（以孢子芽管的长度超过孢子直径的50%视为已萌发孢子），检查各个处理孢子萌发情况，并计算萌发率和抑制率，每个处理重复3次，相应公式：

孢子萌发率=孢子萌发数/总孢子数×100%；

孢子萌发抑制率=（CK孢子萌发数-药剂处理孢子萌发数）/对照孢子萌发数×100%。

1.2.5盆栽防效试验试验于2015年5月中旬—7月上旬草莓育苗期间，从草莓种植区大棚内移取适量的泥土，经无菌处理后，盛装在口径为40 cm、高为25 cm的花盆中至盆高的2/3。选取生长状况较一致的1年生丰香草莓3叶期幼苗数株均匀移植于花盆中，2盆之间的间距为10 cm，其他同常规管理。待其成活后，将草莓灰霉病菌发酵液制成2 000万CFU/mL，每株2 mL均匀喷施于草莓叶面。在人工气候箱（温度25 ℃、相应湿度90%）中培养3～4 d，待草莓植株完全发病后调查病情指数。分别喷施“1.2.4”节所配制的各药剂，以无菌水作空白对照（CK）。每处理20株，连续施药2次，第1次施药与第2次施药间隔7 d。喷药后7 d分别观察记录草莓植株发病情况。

参照农业部农药检定所编写的《农药田间药效试验准则》对病害进行分级，并计算病情指数和防治效果。病情分级标准：0级，无病斑；1级，病斑面积占整个叶面积5%及以下；3级，病斑面积占整个叶面积6%～10%；5级，病斑面积占整個叶面积11%～20%；7级，病斑面积占整个叶面积21%～50%；9级，病斑面积占整个叶面积50%以上。相应公式：

病叶率=调查病叶数/调查总叶数×100%；

病情指数=[∑（各级病叶数×相对级数值）/（调查病叶数×最高级数值）]×100；

防治效果=（对照区病情指数-处理区病情指数）/对照区病情指数×100%。

1.2.6数据处理采用Excel、DPS软件进行数据处理，用新复极差法进行差异显著性分析（α=0.05，α=0.01）。

2结果与分析

2.1拮抗活性的测定

2.1.1SU8菌对草莓灰霉病菌的拮抗效果对峙培养法测得SU8菌对草莓灰霉病菌的抑菌带宽为3.26 cm。该结果表明SU8菌对草莓灰霉病菌具有较强的拮抗效果，与张亚等的研究结果[32]一致。

2.1.2SU8发酵液和乙蒜素乳油对草莓灰霉病菌的拮抗效果由表1可知，SU8发酵液和乙蒜素乳油对草莓灰霉病菌均具有抑制作用。

2.2室内毒力测定

利用菌丝生长速率法进行SU8发酵液与乙蒜素乳油混配的室内毒力测定。结果表明，SU8发酵液与乙蒜素乳油对草莓灰霉病菌的最小抑菌浓度分别为12.50、6.25 mg/L。由表2可知，SU8发酵液对草莓灰霉病病菌的EC50为1 696.4 mg/L，乙蒜素乳油对草莓灰霉病病菌的EC50为1434 mg/L，2种物质以质量比为1 ∶9、1 ∶4、1 ∶1、4 ∶1、9 ∶1混合组配的EC50分别为151.4、114.2、113.6、98.9、96.6 mg/L，其增效系数分别为1.04、1.53、2.33、5.41、8.41。

根据增效系数的联合评价标准可知，2种物质以质量比 9 ∶1 混合组配为协同作用；2种物质以质量比1 ∶4、1 ∶1、4 ∶1、9 ∶1混合组配为增效作用，且以质量比为 9 ∶1、4 ∶1的混合组配增效作用较为明显。

2.3孢子萌发活性抑制测定

表3结果表明，随着时间的增加，病菌孢子萌发率逐渐提高，但不同药剂对病菌孢子萌发的影响不同。在12、24、36 h内，病菌孢子在单一的SU8发酵液中萌发率最高，分别为605%、82.1%、88.5%，均高于其他药剂处理，而以SU8发酵液与乙蒜素乳油按质量比9 ∶1混合组配最低，其萌发率分别为8.5%、13.6%、21.8%。比较它们的孢子萌发抑制率可知，在不同的时间段内以单一的SU8发酵液处理对孢子萌发的抑制率最低，但当SU8发酵液与乙蒜素乳油以质量比 4 ∶1、9 ∶1混配后，2种混合组配对孢子萌发的抑制率均明显高于前2者，其中又以质量比9 ∶1的混合组配最高（表3）。

2.4盆栽防效试验

由表4可知，2次施药，单一乙蒜素乳油防病效果分别为54.7%、47.1%，单一SU8发酵液防病效果分别为8.2%、64%，但均低于同浓度乙蒜素乳油和SU8发酵液2者质量比4 ∶1、9 ∶1混合组配的防病效果，且差异极显著。

3结论与讨论

3.1结论

本研究再一次明确了拮抗细菌SU8的发酵液对草莓灰霉病菌具有较强的抑制效果，且混配的各项试验结果均表明，乙蒜素乳油与SU8发酵液以质量比4 ∶1、9 ∶1混配对草莓灰霉病的防治效果比其单一药剂要好，且以2者质量比9 ∶1混配效果最好。这一结果明确了与SU8发酵液混配，能显著增强乙蒜素乳油对草莓灰霉病的防治效果，并有力论证了铜绿假单胞菌株SU8成为生物农药的可能性，明确了拮抗菌在农业生产病害防治中的重要地位，也表明混配是防治草莓灰霉病的有效途径，为今后防治草莓灰霉病提供了新思路，值得更广范围地研究与推广。尤其是本研究利用2种对环境无污染的生防物质混配，在取得较好防治效果的同时，又明确了2种物质的具体混配比例，为今后剂型的研发与推广提供了试验数据。

3.2讨论

生物防治具有低毒、低殘留、易降解的特点，并且与环境相容，正逐渐成为生产无公害农产品时防治病害的首选[38]。因此，生物农药的研发倍受关注，开发新型生物农药防治草莓灰霉病已成为当前农药研究与开发领域的热点之一。拮抗细菌铜绿假单胞菌SU8发酵液和乙蒜素乳油混配防治草莓灰霉病属于生物防治的范畴，原材料既安全且易得，符合现代农业环保、健康、持续发展的时代要求，值得研究和开发。

大量研究表明，多种植物的活性提取物或微生物菌株的代谢产物可以达到抗灰霉病菌的目的，但大多着重于活性物对灰霉病菌的毒力测定，而对这些活性物质的具体成分确定研究较少。今后应加强活性成分的分离鉴定，探讨活性成分的分子结构与构效关系的研究，以期探索出能合成植物源杀菌剂的先导化合物，并研发科学合理的生物剂型，最终应用于农业生产中。本研究明确了SU8发酵液对草莓灰霉病菌的生长有较强的抑制效果，尤其与乙蒜素乳油混配更能提高其抑菌效果。彭双强等也先后报道了SU8菌株对水稻纹枯病菌、草莓灰霉病菌等多种菌株具有较强的拮抗效果，并且分别采用乙酸乙酯、二氯甲烷和石油醚等溶剂提取SU8的抑菌活性物质，经检测确定了SU8抑菌类物质为吩嗪类物质[39-41]。吩嗪类物质是一种广泛存在于假单胞菌代谢产物中的抑制真菌的抗生素，与众多报道的假单胞生防菌的抑菌活性物质基本相同，故菌株SU8具有作为生防菌的潜力。

在微生物环境中，菌株的拮抗现象屡见不鲜。然而拮抗菌的代谢产物未必对同种微生物有抑制效果。研究发现铜绿假单胞菌SU8发酵液滤液对草莓灰霉病菌具有较强的拮抗效果。本研究利用乙蒜素乳油、SU8发酵液及两者不同质量比的混合组配防治草莓灰霉病。室内毒力试验结果表明，混合组配中以质量比为4 ∶1、9 ∶1的增效效果最为明显，选取2种混合组配开展孢子萌发抑制试验，并进行盆栽防治试验。试验结果均表明，乙蒜素乳油与SU8发酵液混配对草莓灰霉病的防治效果比单一药剂好。这一结果表明，混配是一条有效防治草莓灰霉病的途径，也明确了乙蒜素乳油与SU8发酵液2种生防物质的混配比例，但其增效机制、作用方式与剂型开发还有待进一步研究。

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