陈力 童志远 王丹 徐彭

·论著·

脑血通片对脑缺血损伤的保护作用

陈力 童志远 王丹 徐彭

目的 观察脑血通片对脑缺血损伤的保护作用并探讨其作用机制。方法 采用小鼠全脑缺血、小鼠双侧颈总动脉及迷走神经结扎、小鼠全脑缺血再灌注、大鼠急性不完全脑缺血及胶原蛋白-肾上腺素混合诱导剂诱导的小鼠肺血栓实验模型，观察脑血通低剂量组(NXT-L组)与脑血通高剂量组(NXT-H组)，对脑缺血损伤的保护作用。结果 NXT-H延长小鼠断头喘息的存活时间为(23.26±1.76)s；NXT-L与NXT-H延长小鼠双侧颈总动脉及迷走神经结扎后的死亡时间分别为：(128.33±3.11)s、(1316±7.67)s ；NXT-H可以升高小鼠全脑缺血再灌注模型SOD值为：(150.02±18.51)U/mgprot；NXT-L与NXT-H降低小鼠全脑缺血再灌注模型MDA值分别为：(26.80±1.92)nmol/mgprot、(26.43±1.90)nmol/mgprot；NXT-L与NXT-H降低急性不完全脑缺血模型MDA值分别为：(6.36±1.67)nmol/mgprot、(5.78±0.90)nmol/mgprot；NXT-H降低脑指数为：(0.71±0.04)%；NXT-H降低胶原蛋白-肾上腺素混合诱导剂诱导的小鼠肺血栓实验模型中小鼠死亡数+偏瘫未恢复数为：(2+9=11)只。结论 NXT可以通过升高SOD活性，降低MDA的生成，降低脑血管通透性，发挥对脑组织的保护作用；可以降低胶原蛋白-肾上腺素混合诱导剂诱导的小鼠肺血栓实验模型中小鼠死亡数+偏瘫未恢复数。

脑血通；脑缺血

脑血通片是医院由临床经验方逐步发展起来的自制制剂，具有活血化瘀、通络止痛的效果。主要用于脑动脉硬化和脑血管痉挛所致的血管性头痛。从目前医院使用脑血通片治疗的患者疗效来看，虽然脑血通片具有临床疗效显著，不良反应较少的优点。但脑血通的相关临床研究资料较少，药效学资料支持不足，成为阻碍脑血通片进一步发展的屏障。在院级课题(NO：CYFY13DL-007)资助下，本文将已完成的部分药效学实验结果，报告如下。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 脑血通片：成都医学院第一附属医院自制制剂，批号20130723，规格：0.4 g×100片。步长脑心通胶囊：陕西步长制药有限公司，规格：0.4 g×36粒。阿司匹林肠溶片：石家庄康力药业有限公司，规格：25 mg×100片。盐酸肾上腺素注射液：天津金耀氨基酸有限公司，规格：1 ml∶1 mg。羧甲基纤维素钠(CMC-Na)：规格：500 g。SOD试剂盒(100T/96样)：南京建成生物工程研究所。MDA试剂盒(100T/96样)：南京建成生物工程研究所。考马斯亮蓝试剂盒(100T/96样)：南京建成生物工程研究所。冰乙酸：AR级。无水乙醇:AR级。

1.2 仪器 可见分光光度计：722型；离心机：Certrifuge5702；电热恒温培养箱：TSTP2500；电热恒温水浴锅：HH.S11-Ni22；纯水机：Milli-Q Direct8；千分之一电子天平：METTER-TOLEDO，型号，PL203；万分之一电子天平：Sartorius，型号，BS 124S；电动玻璃组织匀浆机:宁波新芝生物科技股份有限公司，型号，DY89-1。

1.3 实验动物 昆明种小鼠，雌雄各半，18～22 g，四川省人民医院实验动物研究所中心提供，动物合格证号：SCXK(川)2013-15。SD大鼠，雌雄各半，190～240 g，由四川省人民医院实验动物研究所中心提供，动物合格证号：SCXK(川)2013-15。所有实验动物置于恒温、恒湿的饲养条件下，固体饲料，自由饮水。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠全脑缺血实验[1]：小鼠40只，体重18～22 g，雌雄各20只，随机分为4组[CMC空白组，脑血通片低剂量组，脑血通片高剂量组，阳性对照组(步长脑心通组)]，每组10只。4组分别灌胃给予相应药物，且按相应剂量连续给药15 d，于末次给药30 min后，迅速从小鼠双耳后颈部处断头，采用双盲法观察小鼠喘息时间(以小鼠最后一次喘息抽搐的时间为止)。

1.4.2 小鼠双侧颈总动脉及迷走神经结扎实验[2,3]：小鼠40只，体重18～22 g,雌雄各20只，随机分为4组[CMC空白组，脑血通片低剂量组，脑血通片高剂量组，阳性对照组(步长脑心通组)]，每组10只。4组分别灌胃给予相应药物，且按相应剂量连续给药15 d，于末次给药30 min之后，用水合氯醛麻醉动物，分离双侧颈总动脉和伴行的迷走神经，用手术线同时结扎，记录小鼠的存活时间。

1.4.3 小鼠全脑缺血再灌注的影响实验[4,5]：小鼠50只，体重18～22 g，雌雄各20只，随机分为5组[脑血通片低剂量组、脑血通片高剂量组、CMC假手术对照组、CMC手术对照组、阳性对照组(步长脑心通组)]，每组10只。且按相应剂量连续给药15 d，于末次给药1 h后，用1%水合氯醛麻醉，颈部正中切口，分离颈总动脉，用棉线系活结结扎，造成急性全脑缺血损伤模型，阻断20 min后再灌20 min，再阻断20 min，解开结扎线，缝合切口，待小鼠恢复后，继续置于25℃恒温空调房内饲养，24 h后处死老鼠，取脑组织，用冰0.9%氯化钠溶液制成10%组织匀浆，按试剂盒说明书推荐的方法，分别测定超氧化物歧化酶(SOD)与丙二醛(MDA)的含量。

1.4.4 大鼠急性不完全脑缺血实验[6-8]：大鼠50只，体重180～220 g，雌雄各25只，随机分为5组[脑血通片低剂量组、脑血通片高剂量组、CMC假手术对照组、CMC手术对照组、阳性对照组(步长脑心通组)]，每组10只。且按相应剂量连续给药15 d，于末次给药30 min后，以异氟烷呼吸麻醉10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(350 mg/kg)，手术结扎双侧颈总动脉，造成急性不完全脑缺血模型，假手术组仅分离颈总动脉。术后3 h断头处死动物，取脑组织，称重，计算脑指数。以大脑纵裂沿矢状缝为标志，将脑分成左右两部分，称左半脑湿重，置110℃烘箱中48 h后，称其干重，计算左半脑组织的含水量，余下右半脑，分别用冰的0.9%氯化钠溶液制成10%的组织匀浆，按试剂盒说明书推荐的方法分别测定SOD和MDA含量。

1.4.5 胶原蛋白-肾上腺素混合诱导剂诱导的小鼠肺血栓实验[9-11]：小鼠48只，体重20～22 g，雌雄各24只，随机分为4组[脑血通片高剂量组、脑血通片低剂量组、CMC空白对照组、阳性对照组(阿司匹林肠溶片组)]；每组12只，雌雄各6只。4组连续给药15 d，于最后一次给药30 min后，尾静脉注射胶原与肾上腺素的混悬液0.2 ml/只，按文献[9]方法制备胶原与肾上腺素的混悬液：取脱毛的大鼠腹部皮肤，按0.1 g加入1 ml 0.9%氯化钠溶液，利用组织匀浆机将其研碎，再以3 000 r/min，离心10 min，取上清液，加入肾上腺素，使其含量为2 μl/ml。尾静脉注射胶原与肾上腺素混悬液后能造成小白鼠体内肺血栓模型，观察注入胶原蛋白-肾上腺素混悬液后，分别记录5 min内小白鼠死亡和15 min内偏瘫未恢复的动物数。

2 结果

2.1 脑血通片对小鼠全脑缺血死亡时间的保护实验 与CMC空白组比较，脑血通片高剂量组和步长脑心通组小鼠的全脑缺血喘息时间明显延长(P<0.05)。与CMC空白组比较，脑血通片低剂量组小鼠的全脑缺血时的喘息时间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 脑血通片对结扎小鼠双侧颈总动脉及迷走神经的保护实验 与CMC空白组比较，脑血通片低剂量组和脑血通片高剂量组均能延长结扎小鼠双侧颈总动脉及迷走神经小鼠的存活时间(P<0.05)。见表2。

表1 脑血通片对小鼠全脑缺血时的喘息时间影响 ±s

注：与CMC空白组比较，*P<0.05

表2 脑血通片对结扎小鼠双侧颈总动脉及迷走神经时小鼠的存活时间影响 ±s

注：与CMC空白组比较，*P<0.05，#P<0.01

2.3 脑血通片对小鼠全脑缺血再灌注的保护实验 与CMC手术组比较，脑血通片低剂量组能降低MDA值(P<0.05或<0.01),脑血通片高剂量组能升高SDO值(P<0.05或<0.01)，并降低MDA值。见表3。

表3 脑血通片对小鼠全脑缺血再灌注时脑组织匀浆中SOD和MDA含量的影响 ±s

注： 与CMC假手术组比较，*P<0.05，#P<0.01;与CMC手术组比较，△P<0.05，☆P<0.01

2.4 脑血通片对大鼠急性不完全脑缺血的保护实验 与CMC手术组比较，脑血通片高剂量组能够降低大鼠急性不完全脑缺血时的脑指数(P<0.05或<0.01)。脑血通片高剂量组与低剂量组都能降低脑匀浆中的MDA值，但2个剂量组对SOD值差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、5。

表4 脑血通片对大鼠急性不完全脑缺血时的脑指数的影响 ±s

注： 与CMC假手术组比较，*P<0.05;与CMC手术组比较，#P<0.05，△P<0.01

表5 脑血通片对大鼠急性不完全脑缺血时脑组织匀浆中SOD和MDA含量的影响 ±s

注： 与CMC假手术组比较，*P<0.05;与CMC手术组比较，#P<0.05，△P<0.01

2.5 脑血通片对胶原蛋白-肾上腺素混合诱导剂诱导的小鼠肺血栓实验 与CMC空白组比较，脑血通高剂量组可以降低诱导剂诱导的小鼠肺血栓实验的死亡数和偏瘫未恢复数(P<0.05或<0.01)。见表6。

表6 脑血通片对混合诱导剂诱导的小鼠肺血栓实验的死亡数和偏瘫未恢复数 n=12

注：与CMC空白组比较，*P<0.05，#P<0.01；死亡数在最后统计时也应算进偏瘫未恢复数里面

3 讨论

在我国，脑血管疾病与心脏病和癌症，构成了危害人类健康的三大主要疾病[12]。由于脑血管疾病的发病率和年龄增长呈正相关趋势，其已成为我国中老年人致残和死亡的主要原因之一。

脑缺血是由于各种原因引发的脑动脉管腔狭窄或堵塞，造成局部脑血流量突然减少或中断，导致该动脉供应区的脑组织供血、供氧、供能减少，继而引起继发性的血管内皮损伤和自主神经功能障碍的一种病理状态。该状态持续一段时间后，可出现该区域内的脑组织坏死和细胞死亡。

脑缺血后，会引起机体一系列损伤反应。主要表现为：(1)短时间缺血的急性损伤[13]。此时脑部神经细胞出现急性坏死，能量代谢出现异常，氧自由基增多。(2)缺血后再灌注的延迟性损伤。此时由于长时间的缺血，触发了继发性的损伤机制，神经细胞损伤加重，缺血范围逐渐增大。虽然再灌注时候，脑部会恢复一部分的氧气供应，但是由于急性缺血时期抗氧化酶类的大量消耗，因此导致氧自由基进一步增加；同时增加的氧自由基还可以与生物膜上的脂类物质反应形成多种脂质过氧化物，破坏脑毛细血管内皮细胞，引起膜的流动性和通透性发生改变，使细胞膜的结构和功能受损，从而影响水电解质的平衡及膜的稳定性[14,15]。

脑血通片是我院目前治疗脑血管相关疾病的自制制剂。方中川芎能活血行气以通气滞，广泛用于各种瘀血痹痛、丹参活血化瘀，作用温和，不易伤阴血，有利于营血的新生；白芷、蔓荆子、藁本等疏风止痛，以消瘀血、痰浊所致之清窍不利；蜈蚣、全蝎相须为用，通络止痛；土鳖虫活血通经，息风通络，以消瘀血所阻之脉络。全方组方科学，合理共同发挥奏疏风通络、活血行气的功效。在我院使用广泛，患者反应较好。

根据实验结果可知：脑血通片可以延长小鼠断头喘息的存活时间(高剂量组，P<0.01)；也能延长小鼠双侧颈总动脉及迷走神经结扎后的死亡时间(低剂量组，P<0.05；高剂量组，P<0.01)。该研究从整体实验动物的角度，确定了脑血通片对脑缺血损伤的保护作用。

实验也表明：脑血通片在缺血再灌注期(小鼠全脑缺血再灌注试验)中可以通过升高SOD活性(高剂量组，P<0.01)，降低氧自由基的生成(高剂量组，P<0.01)；也能降低急性损伤期大鼠脑血管通透性，降低脑指数(高剂量组，P<0.05)；以及减少胶原蛋白与肾上腺素混合诱导剂所导致的小鼠肺血栓死亡有显著的保护作用(高剂量组，P<0.05)，与相关文献[16,17]结果表现一致；但是在大鼠急性不完全脑缺血实验中，我们虽然观察到了MDA值降低(低剂量组，P<0.05；高剂量组，P<0.01)，但检测到SOD值升高差异无统计学意义(高剂量组与低剂量组均无显著差异)，与文献[18,19]结果不一致，提示脑血通片对急性脑缺血的保护作用仍有待进一步研究。此外，脑血通片对凝血机制和纤溶系统的影响也有待于后续试验的进一步验证。

1 徐叔云,卞如濂,陈修,等主编.药理实验方法学.第2版.北京:人民卫生出版社,1991.948.

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Experimental study on the protective effects of Naoxuetong tablets on cerebral ischemia in mice

CHENLi,TONGZhiyuan,WANGDan,etal.
TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

Objective To explore the protective effects and possible mechanism of Naoxuetong tablets on cerebral ischemia in mice.Methods The animal models were established including global brain ischemia models in mice, bilateral common carotid artery ligation and vagas nerve ligation models in mice,global brain ischemia-reperfusion (I/R) in mice, pulmonary embolism models in mice induced by collagen-epinephrine combination,and acute incomplete brain ischemia models in rats,then the protective effects of Naoxuetong low-dose group (NXT-L group) and Naoxuetong high-dose group (NXT-H group) on cerebral ischemia injury were observed.Results The lengthening survival time of decapitation gasping in mice of NXT-H group was (23.26±1.76)s,and the lengthening survival time after bilateral common carotid artery ligation and vagas nerve ligation in NXT-Lgroup and NXT-H group was (128.33±3.11)s,(1316±7.67)s,respectively.The levels of SOD were (150.02±18.51)U/mgprot in mice with global brain ischemia-reperfusion,which were increased by NXT-H,moreover, NXT-L and NXT-H decreased the MDA levels in mice with global brain ischemia-reperfusion by (26.80±1.92)nmol/mgprot,(26.43±1.90)nmol/mgprot,respectively. However NXT-L and NXT-H decreased the MDA levels in rats with incomplete brain ischemia-reperfusion by (6.36±1.67)nmol/mgprot,(5.78±0.90)nmol/mgprot,respectively. NXT-H could decrease cerebral index by (0.71±0.04)%,and the death number of mice+hemiplegia number (non-recovery) decreased by NXT-H were 11 mice (2+9) in mice models with pulmonary embolism induced by collagen-epinephrine combination.Conclusion NXT can produce protective effects on brain tissue of mice by increasing the activity of SOD, decreasing the production of MDA and reducing cerebral vascular permeability, moreover, which can decrease the death number of mice+hemiplegia number (non-recovery) in mice models with pulmonary embolism induced by collagen-epinephrine combination.

Naoxuetong;cerebral ischemia

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.09.005

项目来源：成都医学院第一附属医院院级课题项目(编号：CYFY13DL-007)

610500 成都市，成都医学院第一附属医院(陈力、童志远、王丹)；江西中医药大学(徐彭)

徐彭，330004 南昌市，江西中医药大学；

E-mail:xp0420@163.com

R 743.31

A

1002-7386(2017)09-1301-04

2016-11-20)