李燕 李嵘

·论著·

奈达铂与鼻咽癌相关蛋白P53、Bcl-2、caspase的表达水平与相关性分析

李燕 李嵘

目的 观察奈达铂对鼻咽癌CNE-2细胞增殖和凋亡的影响，探讨奈达铂与鼻咽癌相关蛋白P53、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、caspase的表达水平与相关性分析。方法 分析不同浓度的奈达铂(0 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml)和作用不同时间(12 h、24 h、36 h、48 h)对鼻咽癌CNE-2细胞增殖和凋亡的影响；分析不同浓度的奈达铂对CNE-2细胞P53、Bcl-2、caspase蛋白表达水平的影响。结果 使用MTT法检测不同浓度的奈达铂对CNE-2细胞增殖的影响，随奈达铂浓度的升高OD值逐渐降低(P<0.05)，且随着奈达铂作用时间的延长OD值逐渐降低(P<0.05)。形态学可见：奈达铂浓度0μg/ml时CNE-2细胞增值迅速、细胞饱满，形态规则；奈达铂作用下细胞增值减慢，细胞变圆、边缘模糊；使用流式细胞仪检测不同浓度的奈达铂对CNE-2细胞凋亡率可见随着奈达铂浓度的升高细胞凋亡率逐渐升高(P<0.05)；使用免疫组化光密度定量检测不同浓度的奈达铂对CNE-2细胞P53、Bcl-2、caspase蛋白表达水平的影响，可见随着奈达铂浓度的升高P53、Bcl-2蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)，caspase蛋白表达水平逐渐升高(P<0.05)。结论 奈达铂能够明显抑制鼻咽癌CNE-2细胞增殖和促进凋亡，其可能与抑制P53、Bcl-2蛋白表达和促进caspase蛋白表达有关。

奈达铂；鼻咽癌CNE-2细胞；细胞增殖；细胞凋亡；P53；Bcl-2；caspase

鼻咽癌为临床上较为常见的头颈外科恶性肿瘤，近年来由于环境污染、生活习惯等的改变，鼻咽癌的发生率呈现出了逐年上升的趋势。相关临床研究表明鼻咽的发病率可达0.5%以上，且近三年来其局部地区的发病率更高[1]。对于Ⅲ期以及Ⅳ期的鼻咽癌患者，手术难以彻底切除病灶，此时通过联合放化疗治疗可以有效改善临床症状、延长生存时间[2,3]。奈达铂是近年来应用较广的细胞毒性药物，在乳腺癌、鼻咽癌以及卵巢癌或者宫颈癌等恶性肿瘤的中晚期化疗治疗中具有显著的临床效果，规范的奈达铂联合化疗的总体有效率可达65%以上，其术后平均生存时间可延长4～6个月[4]。然而迄今为止对于奈达铂的作用机制的研究仍然不足，P53、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、caspase等因子广泛参与到了恶性肿瘤的细胞增殖、凋亡和分化等病理过程，在影响细胞周期、提高细胞凋亡率进而增强化疗药物的敏感性方面具有重要的作用[5,6]，本研究重在探讨奈达铂作用于鼻咽癌细胞CNE-2后相关信号分子的变化，进而进一步揭示奈达铂治疗鼻咽癌的机制，为后续鼻咽癌的临床治疗提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人鼻咽癌细胞株CNE-2来自于华中科技大学同济医学院病理实验室保存。

1.2 细胞增殖测量方法 鼻咽癌CNE-2细胞生长至融合度为90%时，用胰蛋白酶EDTA消化液消化细胞，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，24 h后加入奈达铂，使之浓度梯度分别为0 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml，并设置6复孔，在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中共培养，24 h后每孔加入10 μl新型细胞增殖及毒性检测溶液CCK-8(南京凯基生物科技发展有限公司 KGA317)，酶标仪在450 nm波长处检测每孔的吸光度OD值。

1.3 细胞凋亡率测量方法 鼻咽癌CNE-2细胞生长至融合度为90%时用胰蛋白酶消化液(不含EDTA)消化细胞，离心收集细胞后用PBS洗涤细胞1次(2 000 r/min，5 min)，300 μl的1×Binding Buffer悬浮细胞，之后加入5 μl Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15 min，上机前5 min再加入5 μl的PI染色，避光放置10 min，流式细胞仪检测4组凋亡率。流式细胞仪器FASC-990购自美国ABI公司，细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司，配套试剂购自罗氏检测公司。

1.4 P53、Bcl-2、caspase蛋白表达水平定量分析方法 ELISA法检测 P53、Bcl-2、caspase蛋白细胞消化离心后采用南京凯基生物有限公司生产HSD细胞裂解液裂解细胞，1 000 r/min离心后获取上层清液，4℃保存待测，以标准品稀释液将标准品复溶，静置15 min后混匀，背比稀释为7个浓度，取出板条，除了对照孔外每个孔加入不同浓度的标准品，剂量为100 μl/孔，采用封板盖封住，室温反应120 min，使用PBS液体洗涤3次，除了空白对照孔，每孔加入检测液(100 μl)，室温孵育1 h，PBS洗涤3次，加入底物(50 μl/孔)，避光孵育25 min，加入终止液5 min后测定450 nm处吸光度。 P53、Bcl-2、caspase蛋白抗体购自罗氏检测公司，相关配套试剂购自南京凯基生物科技有限公司，严格按照说明书的要求进行操作。

1.5 观察指标 比较不同浓度的奈达铂(0、5、10、20 μg/ml)作用24 h后对CNE-2细胞增殖的影响；比较10 μg/ml奈达铂作用不同时间(12、24、36、48 h)对CNE-2细胞增殖的影响；比较不同浓度的奈达铂(0、5、10、20 μg/ml)作用24 h后对CNE-2细胞凋亡率的影响；比较不同浓度的奈达铂(0、5、10、20 μg/ml)对CNE-2细胞P53、Bcl-2、caspase蛋白表达水平的影响。

2 结果

2.1 不同浓度奈达铂对CNE-2细胞增值的影响 使用MTT法检测不同浓度的奈达铂刺激CNE-2细胞24h后的OD值，奈达铂浓度0μg/ml时OD值为(0.95±0.07)，5μg/ml的OD值为(0.73±0.05)，10μg/ml的OD值为(0.68±0.06)，20μg/ml的OD值为(0.59±0.04)，可见随着奈达铂浓度的升高OD值逐渐降低，奈达铂可明显抑制CNE-2细胞的增值(P<0.05)。形态学可见：奈达铂浓度0μg/ml时CNE-2细胞增值迅速、细胞饱满，形态规则；奈达铂作用下细胞增值减慢，细胞变圆、边缘模糊。见表1，图1～4。

表1 不同浓度奈达铂对CNE-2细胞增值的影响 ±s

注：与对照组比较,*P<0.05；与5μg/ml组比较,#P<0.05；与10μg/ml组比较,△P<0.05

2.2 不同浓度MMC对肝干细胞的细胞毒作用比较 用10μg/ml奈达铂分别作用12h、24h、36h、48h，使用MTT法检测其OD值分别为(0.84±0.06)、(0.75±0.08)、(0.38±0.04)、(0.31±0.03)，结果可见随着奈达铂作用时间的延长OD值逐渐降低(P<0.05)。见表2。

2.3 不同浓度奈达铂对CNE-2细胞凋亡程度的影响 使用流式细胞仪检测不同浓度的奈达铂刺激CNE-2细胞24h后的细胞凋亡率，奈达铂浓度0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的细胞凋亡率分别为(0.65±0.01)%，(19.82±1.58)%，(40.60±5.46)%，(67.28±1.14)%，可见随着奈达铂浓度的升高细胞凋亡率逐渐升高，奈达铂可明显抑制CNE-2细胞的增值(P<0.05)。见表3。

图1 奈达铂浓度0μg/mlCNE⁃2细胞形态学变化(龙胆紫×400) 图2 奈达铂浓度5μg/mlCNE⁃2细胞形态学变化(龙胆紫×400) 图3 奈达铂浓度10μg/mlCNE⁃2细胞形态学变化(龙胆紫×400) 图4 奈达铂浓度20μg/mlCNE⁃2细胞形态学变化(龙胆紫×400)

表2 奈达铂作用不同时间对CNE-2细胞增值的影响 ±s

注：与12h比较,*P<0.05；与24h比较，#P<0.05

表3 不同浓度奈达铂对CNE-2细胞凋亡的影响 ±s

注：与对照组比较,*P<0.05；与5μg/ml组比较,#P<0.05；与10μg/ml组比较,△P<0.05

2.4 不同浓度奈达铂对P53、Bcl-2、caspase蛋白表达水平的影响 使用免疫组化光密度测定定量检测不同浓度的奈达铂对CNE-2细胞P53、Bcl-2、caspase蛋白表达水平的影响，可见随着奈达铂浓度的升高P53、Bcl-2蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)，caspase蛋白表达水平逐渐升高(P<0.05)。见表4。

组别P53(OD值)Bcl⁃2(OD值)Caspase(OD值)对照组(0μg/ml)0．38±0．070．32±0．050．17±0．035μg/ml组0．29±0．05∗0．25±0．04∗0．24±0．05∗10μg/ml组0．21±0．06∗#0．20±0．04∗#0．28±0．04∗#20μg/ml组0．18±0．03∗#△0．15±0．02∗#△0．35±0．06∗#△ F值10．8127．6298．547 P值<0．01<0．01<0．01

注：与对照组比较,*P<0.05；与5μg/ml组比较,#P<0.05；与10μg/ml组比较,△P<0.05

3 讨论

鼻咽癌是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，是我国高发恶性肿瘤之一，发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首。常见临床症状为鼻塞、涕中带血、耳闷堵感、听力下降、复视及头痛等。鼻咽癌大多对放射治疗具有中度敏感性，放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方法，但对于35%左右的临床分期为Ⅲ期或者更晚期的患者，往往需要联合奈达铂进行联合化疗，进而促进残留鼻咽癌病灶的细胞坏死和凋亡，延长放疗后的生存时间[4]。临床上通过前鼻镜、鼻咽镜或者磁共振检查均有利于发现早期病变，从而有利于早期手术或者放疗治疗。一项汇集了45例鼻咽癌调强放疗的相关临床治疗效果的分析可见，联合静脉奈达铂化疗的总体有效率可上升15%，患者5年内的病死率可下降5%左右[7,8]，但同时研究者在随访化疗的过程中发现，部分鼻咽癌患者化疗后再次进行手术的患者，其术后病灶病理切片免疫组化可见明显的细胞凋亡相关蛋白以及癌基因编码的相关蛋白的异常表达[9,10]。随着近年来对于肿瘤分子生物学研究的进展，以及肿瘤免疫靶向治疗研究的广泛开展，对于鼻咽癌患者化疗过程中相关信号分子的研究，将为后续肿瘤分子免疫靶向治疗提供新的免疫靶向位点。

P53是一个重要的抗癌基因使癌细胞凋亡，从而防止癌变，还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能，通过磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等翻译后修饰调控，P53可以增强其对于鼻咽癌细胞周期的调节，进而抑制细胞过度增殖[11]；Bcl-2基因可以抑制由多种细胞毒因素所引起的细胞死亡，Bcl-2的过度表达能增强所观察细胞对大多数细胞毒素的抵抗性，抑制细胞凋亡、促进肿瘤细胞的过度增殖和耐药[12]；caspase能够特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键，caspase负责选择性地切割某些蛋白质，从而造成细胞凋亡。相关研究证实P53、Bcl-2以及caspase在卵巢癌、乳腺癌等中存在异常表达[13]，但在鼻咽癌CNE-2中的研究不足，本次研究的创新性在于首次探讨了奈达铂影响下的CNE-2的相关信号分子的变化。

使用MTT法检测不同浓度的奈达铂刺激CNE-2细胞24h后的OD值，发现随着奈达铂作用浓度的增加，鼻咽癌细胞CNE-2的增殖明显减缓，OD值持续性下降，同时本次试验研究中通过动态随访不同时间节点的奈达铂作用效果，发现48h后的CNE-2细胞的OD值最低仅为(0.31±0.03)，此时奈达铂抑制鼻咽癌细胞的作用最为明显，表明奈达铂对于CNE-2的抑制作用具有明显的浓度和时间依赖性。光镜下观察可见，在奈达铂的作用下，CNE-2细胞形态发生了明显的变化，失去了原有的形态结构，细胞周边变得粗糙而失去极性。Liu等[14,15]分析了奈达铂作用下CNE-2的细胞增殖率的变化，发现5μg/ml的奈达铂与CNE-2细胞在37℃的培养箱中共培养12h的细胞增殖抑制率可达15%，且随着共培养时间的延长，细胞抑制率更高，OD值更低，结论与本研究较为一致。本研究通过流式细胞技术测定细胞凋亡率发现，奈达铂浓度 0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml，20μg/ml时CNE-2的细胞凋亡率可持续性上升至80%左右，表明在一定范围内增加奈达铂的浓度可以促进鼻咽癌细胞的凋亡。更为重要的是，本研究对于肿瘤相关信号分子的研究发现，在奈达铂的作用下，P53、Bcl-2蛋白表达水平逐渐降低，caspase蛋白表达水平逐渐升高，统计学差异较为明显，其中P53可下降至(0.18±0.03)，而caspase蛋白可上升至0.35左右，表明奈达铂可以通过上调有活性的caspase家族蛋白，抑制P53蛋白的表达，从而参与P53/caspase信号通路的调控，促进细胞凋亡、抑制鼻咽癌细胞的过度增殖，其中P53蛋白表达的抑制可以进一步调节鼻咽癌CNE-2细胞G1/S期细胞比值，进而抑制细胞快速通过G0期的速度，抑制癌细胞的过度增殖。

综上所述，奈达铂能够明显的抑制鼻咽癌CNE-2细胞增殖和促进凋亡，其可能与抑制P53、Bcl-2蛋白表达和促进caspase蛋白表达有关。通过对于鼻咽癌细胞CNE-2相关信号分子的研究将为后续免疫靶向治疗提供新的作用靶点。

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Experimental study on the effects of nedaplatin on expression levels of nasopharyngeal carcinoma related proteins-P53,Bcl-2,caspase

LIYan,LIRong.
DepartmentofOncology,People’sHospitalofMeishanCity,Sichuan,Meishan620010,China

Objective To observe the effects of nedaplatin on cell proliferation and apoptosis of nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells (NPC CNE-2),and to explore the correlation between nedaplatin and the expression levels of nasopharyngeal carcinoma related proteins-P53,Bcl-2,caspase.Methods The effects of nedaplatin on cell proliferation and apoptosis of nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells in different concentrations (0μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml) and in different action time points (12h,24h,36h,48h) were detected by MTT and flow cytometry,respectively. Moreover the effects of nedaplatin on expression levels of P53,Bcl-2,caspase of CNE-2 cells in different concentrations were detected by immunohistochemisty.Results MTT examination results showed that with increase of concentrations of nedaplatin,OD values of CNE-2 cell proliferation were gradually decreased (P<0.05),moreover,withtheprolongationofactiontimeofnedaplatin,theODvaluesweregraduallydecreased(P<0.05).Inconcentrationsofnedaplatin0μg/ml,theCNE-2cellproliferationwasfaster,cellswerefullandcellmorphouswasregular,however,withincreaseofconcentrationsofnedaplatin,cellproliferationwasgraduallydecreased,cellbecameround,withedgeunsharpness.Theflowcytometrydetectionresultsshowedthatwithincreaseofconcentrationsofnedaplatin,theapoptoticrateofCNE-2cellswasgraduallyincreased(P<0.05).Theimmunohistochemistyresultsshowedthatwithincreaseofconcentrationsofnedaplatin,expressionlevelsofP53,Bcl-2weregraduallydecreased(P<0.05),however,the expression levels of caspase were gradually increased (P<0.05).Conclusion The nedaplatin can obviously inhibit the cell proliferation and promote cell apoptosis of NPC CNE-2 cells,which may be correlated to its effects of inhibiting the expressions of p53 and bcl-2 protein and promoting the expression of caspase protein.

nedaplatin; nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells; cell proliferation; cell apoptosis; P53; Bcl-2; caspase

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.09.001

620010 四川省眉山市人民医院肿瘤科

R

A

1002-7386(2017)09-1285-04

2016-11-21)