刘 丹，刘 婷，赵 乐，李 旭

(1.西安交通大学第一附属医院妇产科，陕西 西安 710061；2.西安交通大学第一附属医院转化医学中心，陕西 西安 710061)

人参皂苷Rg1通过NF-κB阻断缺氧诱导卵巢癌SKOV3细胞EMT

刘 丹1，刘 婷1，赵 乐2，李 旭2

(1.西安交通大学第一附属医院妇产科，陕西 西安 710061；2.西安交通大学第一附属医院转化医学中心，陕西 西安 710061)

目的 探讨人参皂苷Rg1对卵巢癌SKOV3细胞上皮间质转化的影响及机制。方法 确定人参皂苷Rg1对SKOV3细胞生长的影响，构建缺氧诱导上皮间质转化(EMT)模型，观察细胞形态变化，检测E-cadherin，vimentin及核因子KappaB(NF-κB)蛋白的表达。结果 不同浓度的人参皂苷Rg1处理SKOV3细胞，超过40μg/mL的Rg1培养24h时对细胞生长稍有抑制，培养48h和72h时对细胞生长无明显抑制。缺氧诱导48h，SKOV3细胞呈现纺锤形、松散排列的形态，E-cadherin蛋白表达消失，vimentin蛋白表达增强。40μg/mL人参皂苷Rg1处理缺氧诱导的SKOV3细胞48h，细胞形态变化被部分逆转。E-cadherin蛋白表达恢复，vimentin蛋白表达被抑制，同时，NF-κB蛋白的表达与E-cadherin呈相反的趋势。结论 人参皂苷Rg1可能通过调控NF-κB抑制缺氧诱导卵巢癌SKOV3细胞的EMT。

人参皂苷Rg1；上皮间质转化；E-钙黏素；波形蛋白；核因子KappaB

卵巢癌是女性生殖器官常见恶性肿瘤之一，由于缺乏早期诊断方法，且易发生早期转移及扩散，中晚期卵巢癌的死亡率一直居高不下[1]。上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)是肿瘤转移侵袭的一种重要机制[2-3]，指具有极性的上皮细胞在某种环境下从紧密连接的上皮细胞形态转换为间质细胞形态，细胞失去极性，细胞间黏附减弱，运动功能增强。上皮细胞标志物如E-钙黏素(E-cadherin)表达减弱，而间质细胞标志物如波形蛋白(vimentin)表达增强。多项研究已证实通过抑制EMT过程，卵巢癌细胞的转移和侵袭都被抑制[4-6]。核因子KappaB(NF-κB)是一种普遍存在的多功能转录因子，其在肿瘤发生中的作用已被公认。有研究发现，NF-κB高表达与上皮性卵巢癌化疗耐药及预后不良有关，NF-κB可调控上皮表型相关抑制基因的转录，还可促进间质细胞特征的出现和维持，促进和保持细胞呈现侵袭的表型[7-8]。因此，NF-κB信号通路可能是卵巢癌细胞EMT中的一个重要分子。

人参皂苷Rg1是中药人参提取物中含量最高的单体[9]，可清除自由基、对抗氧化应激、减少凋亡，能有效减轻细胞的缺血再灌注损伤及皮肤的紫外线损伤[10-13]。Yu 等[14]研究发现人参皂苷Rg1可抑制转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)诱导下肝癌HepG2细胞的EMT过程，从而减弱细胞的侵袭和转移。Li等[15]发现人参皂苷Rg1可通过抑制NF-κB依赖的基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)表达，从而抑制向二乙酸酯(phorbol myristate acetate，PMA)诱导下乳腺癌MCF-7细胞的侵袭和转移。然而，人参皂苷Rg1在卵巢癌侵袭转移中的作用鲜有报道。

本研究拟通过构建人卵巢癌SKOV3细胞缺氧模型，诱导细胞发生EMT，探讨人参皂苷Rg1对卵巢癌细胞EMT的影响，并初步证实NF-κB在其中的作用。

1资料与方法

1.1细胞培养及缺氧模型的建立

人卵巢癌细胞SKOV3(中科院上海细胞库)常规培养于完全培养基，内含10%新生小牛血清的RPMI 1640培养液(美国GIBCO公司)，及含100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素，在37℃、5%CO2培养箱中培养(Model3111，美国Forma公司)。缺氧处理时将SKOV3细胞放入HF100三气培养箱(HF100，香港Heal Force公司)中以1% O2, 5%CO2, 94% N2，37℃, 100%湿度条件进行培养24h，倒置显微镜观察细胞形态。缺氧处理前加入干预药物后立即放入三气培养箱进行缺氧，处理48h后取出细胞迅速进行蛋白提取处理。

1.2细胞增殖力检测

将对数生长期的人卵巢癌SKOV3细胞接种于96孔板培养24小时，设对照组及不同浓度人参皂苷Rg1(天津天士力制药公司)组(0、2.5、5、10、20、40、80、160、320、640μg/mL)，每组设3个复孔，继续培养至24h、48h和72h时分别进行噻唑蓝[3-(4,5)-dimethylthiahiazo,(z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT]法检测。每孔加入5mg/mL MTT 20μL，继续培养3～4h，加入150μL二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide， DMSO)溶液，震荡15min使紫色结晶充分溶解。多功能酶标仪检测各孔570nm的吸光值。实验重复3次。细胞增殖率(%)=(实验组 OD 值/对照组OD 值)×100%。以药物浓度为横坐标，细胞增殖率为纵坐标采用GraphPad软件绘制曲线图。

1.3蛋白免疫印迹法

卵巢癌细胞SKOV3接种于6孔板中，24h贴壁后各组进行缺氧和/或加药处理，48h后提取蛋白。弃去培养液，预冷磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline， PBS)清洗贴壁细胞3次后加入RIPA (radio-immunoprecipitation assay)裂解液，置于冰上裂解30min，轻晃使其充分裂解，12 000rpm离心30min，收集上清即为细胞总蛋白。采用二喹啉甲酸 (bicinchoni-nic acid，BCA)比色法试剂盒测定细胞总蛋白质的浓度。在蛋白样品中加入聚丙烯酰氨凝胶电泳上样缓冲液，沸煮5min使其充分变性。蛋白上样，行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE)，湿转法将样品转至硝酸纤维素滤膜上，于5%的脱脂奶粉TBST缓冲液室温下脱色摇床上封闭1h。加入1:500兔抗人E-cadherin多克隆抗体(南京Bioworld公司)(或1:1 000兔抗人vimentin单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，或1:500小鼠抗人β-actin多克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，或1:500兔抗人NF-κB多克隆抗体(美国Cayman Chemical公司))，4 ℃孵育过夜；加入1:2 000辣根过氧化酶标记的山羊抗兔抗体(美国Pierce公司)或1:2 000辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠抗体(美国Pierce公司)，室温孵育1h。电化学发光法(electro-chemi-luminescence， ECL)显影。

1.4统计学方法

2结果

2.1不同浓度的人参皂苷Rg1对SKOV3细胞生长的影响

用不同浓度的人参皂苷Rg1处理SKOV3细胞24h、48h和96h，发现培养24h时，Rg1浓度超过40μg/mL时对细胞生长稍有抑制，培养48h时细胞生长无明显变化，而培养72h时细胞生长稍有增强，见图1。因此，选择40μg/mL人参皂苷Rg1，培养24h、48h进行后续试验。

图1 不同浓度人参皂苷Rg1对卵巢癌SKOV3细胞生长的影响

Fig.1 The proliferation of ovarian cancer cell SKOV3 at different concentration of GRg1

2.2 缺氧条件下人参皂苷Rg1对卵巢癌细胞SKOV3形态的影响

经过前期实验，已成功通过三气培养箱构建缺氧诱导EMT模型[16]。如图2所示，常氧状态下，SKOV3细胞呈现多角形或卵圆形，连接紧密，缺氧48h后，SKOV3细胞排列松散，细胞极性消失，呈纺锤形成纤维细胞形态，有的细胞出现丝状伪足，呈现典型的上皮间质转化形态。加入人参皂苷Rg1后，SKOV3细胞的EMT形态变化被部分逆转，松散的细胞排列逐渐靠拢，梭状细胞恢复为多角形铺路石样形态。

注：A 为常氧状态下SKOV3细胞形态(control); B为缺氧(Hypoxia)48h SKOV3细胞形态(Ho48h);C为Rg1 +缺氧48h SKOV3 细胞形态(Ho48h+Rg1)。

图2 缺氧条件下人参皂苷Rg1对卵巢癌细胞SKOV3形态的影响(×200)

Fig. 2 The morphology change of ovarian cancer cell SKOV3 under hypoxia after treatment with GRg1(×200)

2.3 缺氧条件下人参皂苷Rg1对卵巢癌SKOV3细胞EMT相关标志物表达的影响

缺氧48h后，SKOV3细胞上皮细胞标志物E-cadherin蛋白表达消失，间质细胞标志物vimentin蛋白表达增强，说明缺氧后，卵巢癌SKOV3细胞发生了EMT。加入40μg/mL的人参皂苷Rg1培养48h后，上皮细胞标志物E-cadherin蛋白表达恢复，而间质细胞标志物vimentin蛋白的增强表达被抑制，说明Rg1可抑制SKOV3细胞经缺氧诱导后的EMT现象，见图3。

注：*P<0.05 ,**P<0.01。

图3 人参皂苷Rg1阻断缺氧诱导卵巢癌SKOV3细胞EMT相关标志物表达

Fig. 3 The expression of EMT markers in SKOV3 under hypoxia after treatment with GRg1

2.4人参皂苷Rg1可能通过NF-κB阻断缺氧诱导卵巢癌SKOV3细胞EMT

如图4所示，缺氧诱导48h后，NF-κB蛋白表达增强，而经人参皂苷Rg1处理后，NF-κB的表达被抑制。NF-κB的表达变化与上皮细胞标志物E-cadherin的表达呈现相反的趋势。

注：*P<0.05**P<0.01)

图4 人参皂苷Rg1可能通过NF-κB阻断缺氧诱导卵巢癌SKOV3细胞EMT

Fig.4 GRg1 may inhibit hyoxia induced EMT in ovarian cancer cell SKOV3 through NF-κB

3讨论

3.1人参皂苷Rg1可在体外阻断缺氧诱导人卵巢癌SKOV3细胞的EMT

阻断卵巢癌细胞EMT已成为治疗卵巢癌的一种新思路。有研究发现：1α,25(OH)2D3可通过降低转录因子slug、snail和β-catenin的表达，阻断卵巢癌SKOV3细胞的EMT过程，抑制卵巢癌细胞的侵袭和转移[17]。大黄素可通过调控GSK-3β/β-catenin/ZEB1信号通路抑制卵巢癌SKOV3细胞的EMT，从而抑制细胞的侵袭[18]。舒尼替尼可通过下调TGF-β介导的EMT过程抑制卵巢癌SKOV3细胞的侵袭和转移[19]。体外诱导EMT现象的方法有很多，在我们的前期研究中，通过比较4种缺氧模型，发现三气培养箱可明显诱导细胞发生EMT，并且可人为调控氧气浓度、培养湿度和温度，缺氧环境稳定而持久[16]。因此本研究采用三气培养箱作为卵巢癌细胞缺氧EMT的诱导条件。缺氧诱导后，人卵巢癌SKOV3细胞从上皮细胞形态转化为间质细胞形态，上皮标志物E-cadherin表达消失，间质标志物vimentin表达增强，提示EMT诱导成功。经过人参皂苷Rg1处理后，SKOV3细胞缺氧诱导后的变化发生了逆转，细胞形态部分恢复为上皮细胞形态，上皮标志物表达恢复，间质标志物表达减弱。说明人参皂苷Rg1可以阻断缺氧诱导人卵巢癌SKOV3细胞的EMT，提示其可能成为卵巢癌转移治疗中的候选药物。

3.2人参皂苷Rg1可能通过调控NF-κB表达阻断缺氧诱导卵巢癌SKOV3细胞EMT

NF-κB以二聚体的形式参与细胞生长、炎症反应、EMT等多种生物进程，其家族成员包括RelA/p65、NFkB1/p50、NFkB2/p52、c-Rel和RelB。静息状态下，NF-κB二聚体在细胞质中与抑制蛋白IKB结合形成复合物，阻止NF-κB进入细胞核，抑制靶基因的转录激活。而在某些刺激因子作用下，IKB蛋白磷酸化，IKB复合物发生泛素化并被降解，游离的NF-κB进入细胞核，与DNA结合，转录调控下游靶基因的表达。NF-κB参与E-cadherin, MMP2，snail家族等多种基因的调控，可与Twist蛋白基因启动子调节序列结合并上调ZEB1基因，从而抑制E-cadherin 的表达，诱导EMT 发生[20]。有报道，MED28可通过NF-κB通路调控乳腺癌细胞MCF7经阿霉素诱导的EMT[21]。敲除根蛋白的胃癌SGC-7901细胞通过调控NF-κB /Snail通路，E-cadherin表达增强，细胞迁移能力下降[22]。Nomura 等[23]发现抑制NF-κB通路不仅可降低胰腺癌细胞EMT基因的表达，而且可抑制淋巴血管及神经的浸润。我们也检测了缺氧诱导EMT中NF-κB的变化，发现缺氧诱导卵巢癌SKOV3细胞EMT，与E-cadherin表达趋势相反，NF-κB表达升高，而经人参皂苷Rg1处理后，其表达明显降低。提示人参皂苷Rg1可能是通过调控NF-κB表达抑制人卵巢癌SKOV3细胞EMT，从而发挥抗肿瘤侵袭的作用。

实验结果显示，中药单体人参皂苷Rg1可在体外发挥阻断卵巢癌EMT的作用。人参皂苷Rg1对卵巢癌细胞的生长没有显著影响，可阻断缺氧诱导卵巢癌SKOV3细胞的EMT，这一过程可能是通过调控NF-κB通路实现的。这一结果，提示人参皂苷Rg1不仅具有抗肿瘤侵袭转移的潜能，而且对细胞的毒副作用小，有可能成为新一代抗肿瘤药物。

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[专业责任编辑： 安瑞芳]

Ginsenoside Rg1 regulating NF-kappaB to block hypoxia for inducing EMT in ovarian cancer cell SKOV3

LIU Dan1, LIU Ting1, ZHAO Le2, LI Xu2

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics; 2.CenterforTranslationalMedicine,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061China)

Objective To investigate the effects and mechanisms of ginsenoside Rg1 on epithelial mesenchymal transition (EMT) in ovarian cancer cell SKOV3. Methods Hypoxia model was set up to induce EMT in ovarian cancer cell SKOV3 and determine the effects of ginsenoside Rg1 on proliferation of SKOV3 cells. Cell morphology changes were observed and the expressions of E-cadherin, vimentin and NF-kappaB were measured. Results SKOV3 cells were treated with ginsenoside Rg1 at different concentration. The proliferation of SKOV3 was a little depressed when the concentration reached more than 40μg/mL at 24h, but the proliferation was not affected at 48h and 72h. After hypoxia induction for 48h, the morphology of SKOV3 cell presented as spindel-like and loosing type, the expression of E-cadherin diminished but the mesenchymal marker vimentin elevated. Treatment with 40μg/mL ginsenoside Rg1 for 48h, the EMT morphology change induced by hypoxia was partially reversed. The expression of E-cadherin recovered and expression of vimentin attenuated. At the same time, the expression of NF-κB showed a contrary change with E-cadherin. Conclusion Ginsenoside Rg1 may inhibit EMT induced by hypoxia in ovarian cancer SKOV3 cells by regulating NF-κB pathway.

ginsenoside Rg1; epithelial to mesenchymal transition; E-cadherin; vimentin; NF-κB

2017-02-13

刘 丹(1982-)，女，主治医师，博士在读，主要从事妇产科临床工作。

李 旭，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.03.017

R737.31

A

1673-5293(2017)03-0273-03