赵孟雷

番茄红素对荷肝癌裸小鼠移植瘤生长的作用及机制研究

赵孟雷*

目的 研究番茄红素(Lycopene，LP)对荷肝癌裸小鼠移植瘤生长的影响及其机制。方法 通过背部皮下注射接种肝癌HepG2细胞的方法建立荷肝癌裸小鼠模型，并分别腹腔注射5、10、20 mg/(kg·d)的LP和2 mg/(kg·d)的顺铂进行干预治疗，疗程为14 d。治疗后，观察各组裸小鼠的一般生存状态及肿瘤生长状况，称取瘤体质量并计算抑瘤率；通过苏木精-尹红(HE)染色观察肿瘤组织形态结构改变，末端标记法(TUNEL)检测肿瘤组织细胞凋亡状况，免疫组织化学法(IHC)观察肿瘤组织凋亡相关蛋白(caspase-3、Bax、bcl-2)表达。结果 经LP治疗14 d，荷肝癌裸小鼠饮食状况和精神状态明显改善，瘤体减小，活动度和硬度降低，肿瘤组织呈现细胞皱缩、片状坏死等病理性改变，凋亡细胞数量明显增多；瘤体质量显著减轻、抑瘤率显著升高；肿瘤组织中caspase-3和Bax表达显著上调，而bcl-2显著下调，Bax/bcl-2比值显著升高；LP上述作用均具有一定的剂量依赖性。结论 番茄红素对荷肝癌裸小鼠移植瘤生长具有一定的抑制作用，其机制可能与番茄红素调节凋亡相关基因蛋白表达而促进肿瘤组织细胞凋亡有关。

番茄红素；肝癌；移植瘤；裸小鼠

0 引言

番茄红素(Lycopene，LP)是广泛存在于蔬菜水果中的一种具有多种生物学活性的胡萝卜素[1-4]，近年来，番茄红素的抗肿瘤作用逐渐得到医药工作者的普遍关注，既往研究发现，番茄红素对肺癌、胃癌、前列腺癌等均具有一定的抑制作用[5-7]，但番茄红素对肝癌是否具有治疗作用尚未见文献报道。既往病理生理学研究发现，促进肿瘤细胞凋亡是抑制肿瘤生长的重要机制之一[8]，而赵其辉等[9]研究发现，LP能够通过促进细胞凋亡而表现出对人结肠癌生长的抑制作用。本实验通过皮下注射接种人肝癌HepG2细胞，建立荷肝癌裸小鼠模型，并给予LP进行干预治疗，通过相关指标检测，探讨LP对荷肝癌裸小鼠移植瘤生长的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞 Balb/C裸小鼠(雄性，鼠龄4～6周龄，体重18～22 g)购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号：SCXK(沪)2012-0005，实验前适应性饲养1周；人肝癌HepG2细胞株由河北医科大学细胞生物研究室惠赠。

1.2 药物与试剂 番茄红素购自南京泽朗生物科技有限公司(纯度≥96%)；注射用顺铂购自山东齐鲁制药有限公司；DMEM 高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购自Gibco公司；caspase-3、Bax、bcl-2单克隆抗体和SP免疫组织化学试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；TUNEL试剂盒购自南京建成生物研究所。

1.3 模型的制备、分组与给药 荷肝癌裸小鼠模型的制备[10]：人肝癌HepG2细胞株经复苏后，植入DMEM高糖培养基，进行培养，并取对数生长期细胞进行下一步实验：调整浓度为2×107个/mL后注射接种(0.5 mL)于裸小鼠背部右后腿外侧皮下，7 d后接种部位出现>0.3 cm2移植瘤即可认定为造模成功。取80只裸小鼠模型按随机数字表法分为阴性对照组、LP [5、10、20 mg/(kg·d)]组和顺铂[2 mg/(kg·d)]组，各16只；疗程14 d，阴性对照组给予等体积生理盐水。

1.4 观察各组裸小鼠生存状态和肿瘤组织生长状况 小鼠生存状态包括：饮食状况、精神状态等；瘤体特征包括：瘤体大小、活动度、硬度等。

1.5 测定瘤体质量和抑瘤率 颈椎脱臼处死动物后剥取肿瘤组织并称重，抑瘤率的计算公式：抑瘤率(%)=(阴性对照组瘤重-治疗组瘤重)/阴性对照组瘤重×100%

1.6 肿瘤组织形态结构改变和细胞凋亡状况 取称重后肿瘤组织置于4%多聚甲醛溶液中进行固定后，依次行石蜡包埋、切片、脱蜡水化、常规HE染色和复染，然后通过显微镜观察肿瘤组织形态结构改变。肿瘤组织石蜡切片经常规脱蜡水化处理后，按照TUNEL试剂盒说明书步骤进行处理，然后通过显微镜观察细胞凋亡状况；凋亡指数(Apoptosis Index，AI)的计算：计数每张染色切片中细胞总数和凋亡细胞数，然后计算AI。AI(%)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%

1.7 肿瘤组织凋亡相关蛋白表达的检测 取肿瘤组织石蜡切片，按照SP试剂盒说明书步骤，采用免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)检测凋亡相关蛋白(caspase-3、Bax、bcl-2)表达；半定量分析：每张染色组织切片随机选取5个视野，通过医学图像分析软件，测定每个视野平均光密度(Optical density，OD)，以OD值代表caspase-3、Bax、bcl-2蛋白表达密度；并根据Bax、bcl-2表达OD值计算Bax/bcl-2比值。

1.8 统计学方法 运用SPSS 15.0进行数理统计分析，计量资料组间均数比较采用one-way ANOVA分析，两两比较采用LSD检验；计数资料比较采用χ2检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组裸小鼠生存状态及肿瘤特征 阴性对照组裸小鼠呈现精神萎靡不振、饮食状况差等状态，肿瘤组织呈现质硬、活动、与胸壁不黏连等特征。与阴性对照组比较，LP各剂量组和顺铂组荷肝癌裸小鼠饮食状况、精神状态等一般生存状态均呈不同程度好转，瘤体减小，活动度和硬度均有所降低，LP作用具有一定剂量依赖性。

2.2 各组裸小鼠移植瘤瘤体质量和抑瘤率 与阴性对照组比较，LP或顺铂治疗14 d，能够显著降低荷肝癌裸小鼠移植瘤瘤体质量，并显著提高抑瘤率(P<0.05，P<0.01)；LP 20 mg/(kg·d)组瘤重和抑瘤率与顺铂2 mg/(kg·d)组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.3 各组裸小鼠肿瘤组织形态结构改变 观察HE染色病理切片，结果如图2所示：阴性对照组荷肝癌裸小鼠移植瘤组织形态和细胞结构均未见异常；与阴性对照组比较，LP各剂量组和顺铂组移植瘤组织细胞呈现不同程度皱缩、细胞数量减少、细胞间隙增大、片状坏死等病理性改变，LP该作用呈现一定剂量依赖性。

图1 各组裸小鼠移植瘤瘤体质量和抑瘤率 注：与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。LP1组：LP 5 mg/(kg·d);LP2组：LP 10 mg/(kg·d); LP3组：LP 20 mg/(kg·d);顺铂组：顺铂2 mg/(kg·d)

2.4 各组裸小鼠肿瘤组织细胞凋亡状况 阴性对照组裸小鼠移植瘤组织存在极少量凋亡细胞，而LP各剂量和顺铂2 mg/(kg·d)组裸小鼠移植瘤凋亡细胞数量较阴性对照组明显增多，LP该作用具有一定的剂量依赖性。见图3。计算AI结果如图4所示：阴性对照组AI为2.58%±1.16%，LP [5、10、20 mg/(kg·d)组和顺铂2 mg/(kg·d)组AI分别为23.04%±5.31%、40.29%±7.46%、61.07%±9.58%、46.91%±6.72%。治疗14 d后，与阴性对照组比较，LP各剂量组及顺铂组荷肝癌裸小鼠移植瘤细胞AI显著提高(P<0.01)；LP 20 mg/(kg·d)组AI较顺铂2 mg/(kg·d)组显著升高(P<0.05)。

2.5 各组裸小鼠移植瘤组织中caspase-3蛋白表达 LP各剂量组和顺铂2 mg/(kg·d)组裸小鼠移植瘤组织中caspase-3蛋白表达较阴性对照组显著上调，LP该作用具有一定剂量依赖性见图5。半定量分析结果如表3所示：LP[10、20 mg/(kg·d)]组和顺铂2 mg/(kg·d)组裸小鼠移植瘤组织IHC染色切片caspase-3蛋白表达OD值较阴性对照组显著升高(P<0.05，P<0.01)；其中LP 20 mg/(kg·d)组caspase-3蛋白表达OD值显著高于顺铂2 mg/(kg·d)组(P<0.05)。

图2 各组裸小鼠肿瘤组织形态结构改变(HE，400×) 注：A：阴性对照组；B：LP 5 mg/kg组；C：LP 10 mg/kg组；D：LP 20 mg/kg组；E：顺铂2 mg/kg组(下同)

图3 各组裸小鼠肿瘤组织细胞凋亡状况(TUNEL，400×)

图4 各组裸小鼠肿瘤组织细胞AI比较

注：与阴性对照组比较，**P<0.01；与顺铂组比较，△P<0.05。

LP1组：LP 5 mg/(kg·d);LP2组：LP 10 mg/(kg·d);LP3组：LP 20 mg/(kg·d);顺铂组：顺铂2 mg/(kg·d)

2.6 各组裸小鼠移植瘤组织bcl-2蛋白和Bax蛋白表达 结果如图6、图7所示：LP各剂量组和顺

铂2 mg/(kg·d)组裸小鼠移植瘤组织中bcl-2蛋白表达较阴性对照组呈不同程度下调，Bax蛋白表达呈不同程度上调，LP上述作用均具有一定剂量依赖性。半定量分析结果如表1所示：LP[10、20 mg/(kg·d)]组和顺铂2 mg/(kg·d)组裸小鼠移植瘤组织IHC染色切片Bax蛋白表达OD值显著上调，bcl-2蛋白表达OD值显著下调，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；LP 20 mg/(kg·d)组bcl-2、Bax蛋白表达较顺铂2 mg/(kg·d)组差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.7 各组裸小鼠移植瘤组织中Bax/bcl-2比值 结果如表1所示，与阴性对照组比较，LP或顺铂治疗14 d能够显著提高荷肝癌裸小鼠移植瘤组织Bax/bcl-2表达比值，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；LP 20 mg/(kg·d)组肿瘤组织Bax/bcl-2表达比值较顺铂2 mg/(kg·d)组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

图5 各组裸小鼠移植瘤组织中caspase-3蛋白表达(IHC，400×)

图6 各组裸小鼠移植瘤组织bcl-2蛋白表达(IHC，400×)

图7 各组裸小鼠移植瘤组织Bax蛋白表达(IHC，400×)表1 各组裸小鼠移植瘤组织中caspase-3、Bax、bcl-2表达OD值及Bax/bcl-2比值

组别只数caspase-3(OD)Bax(OD)bcl-2(OD)Bax/bcl-2阴性对照组160.08±0.020.29±0.070.50±0.090.58±0.16LP5mg/(kg·d)组160.15±0.04*0.53±0.11**0.46±0.121.14±0.23*LP10mg/(kg·d)组160.18±0.04**0.65±0.14**0.38±0.06*1.71±0.38**LP20mg/(kg·d)组160.21±0.05**△0.82±0.19**0.31±0.05**2.65±0.74**△顺铂2mg/(kg·d)组160.16±0.04*0.75±0.13**0.35±0.08**2.14±0.48**

注：与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与顺铂组比较，△P<0.05

3 讨论

肝癌具有发病隐匿、发展迅速、转移及侵袭能力强、恶性度高的特点[11-12]，目前临床上对于肝癌的治疗主要采取手术切除结合术后放化疗的综合治疗方案[13-16]，但大多数患者就诊时已达病程中晚期、失去手术机会，目前临床上手术切除率仅为20%[17]，且5年复发率高达60%以上[18]，严重威胁人类的生命健康。所以研发能够有效抑制肝脏肿瘤生长和复发的新型药物是迫待解决的临床难题。

LP是一种具有多种生物学活性的胡萝卜素，广泛存在于蔬菜和水果中。张涛等[19]和唐莉莉等[20]通过体外实验研究发现，LP能够通过改变细胞周期而抑制前列腺癌细胞增殖；张卫国等[21]研究发现，LP能够通过干预NDA合成、改变细胞周期而表现出对胃癌细胞增殖的抑制作用。本实验通过建立荷肝癌裸小鼠模型并给予LP干预进行治疗，结果显示，LP治疗14 d，能够有效改善荷肝癌裸小鼠的生存状态，降低瘤体硬度和活动度，抑制移植瘤生长、提高抑瘤率，此外，LP还能够诱导肿瘤组织细胞坏死，并促进肿瘤组织细胞凋亡；提示LP对荷肝癌裸小鼠移植瘤生长具有一定的抑制作用。

细胞凋亡过程由多种基因参与调控，其中caspase-3是激活各种凋亡刺激因子(Apaf-1)的关键蛋白酶，参与细胞凋亡的启动及整个凋亡过程的调节；bcl-2能够抑制线粒体破裂，可直接与Apaf-1结合而抑制caspase-3激活，抑制促凋亡蛋白Bax的细胞毒性作用，调节细胞内钙浓度，从而起到抑制细胞凋亡的作用[22-23]；Bax属于bcl-2基因家族成员，诱导线粒体渗透性改变而释放细胞色素C，激活促凋亡蛋白caspase-9，从而表现出促细胞凋亡的作用[24]。此外，Bax能够与bcl-2聚合成二聚体，从而抑制bcl-2活性而促进细胞凋亡，所以Bax/bcl-2比值能够明显体现bcl-2基因家族对细胞凋亡的调控作用[25-26]。本研究发现，LP治疗14 d能够有效上调荷肝癌裸小鼠肿瘤组织caspase-3蛋白和Bax蛋白表达，下调bcl-2表达，提高Bax/bcl-2比值，这可能是LP诱导移植瘤细胞凋亡的重要分子机制之一。

总之，LP可能通过诱导移植瘤细胞凋亡从而对荷肝癌裸小鼠移植瘤生长起到一定的抑制作用，其机制可能与LP能够调节凋亡相关蛋白表达有关。

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Effects and mechanism of lycopene on xenografts growth in liver cancer of nude mice

ZHAO Meng-lei*

(Department of the 3rd General Surgery,Handan Central Hospital,Handan 056001,China)

Objective To investigate the effects of Lycopene (LP) on xenografts growth in liver cancer of nude mice.Methods The nude mice models bearing liver cancer were made by injecting inoculation human liver cell line HepG2 and were treated with 5,10 and 20 mg/(kg·d) of LP and 2 mg/(kg·d) of cisplatin for 14 d.The rats′ general states and tumor growth conditions were observed,and the histopathological change of tumor tissue was observed by HE staining.The tumor cells apoptosis was detected by TUNEL.The expression of caspase-3,Bax and bcl-2 protein was detected by immunohistochemistry (IHC).Results The food and mental condition was improved after nude mice bearing liver cancer was treated with LP for 14 d,the tumor was reduced,and the activity and hardness was decreased.There were necrosis presentation,tumor cell shrinkage and other pathological morphological changes that appeared,and the number of apoptotic cells in tumor tissue was increased.The tumor weights of LP groups were decreased and the inhibition rates were increased.The expression of caspase-3 and Bax was significantly increased,while the expression of bcl-2 protein was decreased,and the ratio of Bax/bcl-2 was significantly increased;all the above effects were dose-dependent.Conclusion LP has inhibitive effects on xenografts growth in liver cancer of nude mice,which is perhaps related to its effects of regulating the expression of apoptosis-related genes and protein to promote tumor cell apoptosis.

Lycopene;Liver cancer;Xenografts;Nude mice

2016-10-06

河北省邯郸市中心医院普外三科，河北 邯郸 056001

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201704002