王洁，张振新，王雅梅

(内蒙古农业大学材料科学与艺术设计学院，呼和浩特010018)

微纳米黄连的制备及其对木材白腐菌的抑菌性

王洁，张振新，王雅梅*

(内蒙古农业大学材料科学与艺术设计学院，呼和浩特010018)

以中草药黄连为原料，使用物理干法球磨制备微纳米黄连，检测其对木材的防腐效果。采用正交试验方法研究球磨转速、球磨时间、小球数对微纳米黄连制备的影响，并确定最佳制备条件和最小抑菌质量浓度，以激光粒度仪与扫描电子显微镜(SEM)对微纳米黄连的粒度分布与形貌进行检测。结果表明：微纳米黄连粉体较普通黄连粉体有更明显的抑菌效果，经过试验筛选得出制备微纳米黄连粉体的最佳工艺条件为球磨转速280 r/min、球磨时间4 h、小球数60个，此时菌落直径仅为2.91 mm，最小抑菌质量浓度为0.5 mg/mL。SEM与显微粒度检测结果显示，微纳米黄连的主要形貌为块状和不规则的球状，粒度分布均匀且为分散状，粒径宽度和长度大多分布在200～700 nm。

微纳米；木材防腐剂；黄连；干法球磨；抑菌；白腐菌

木材防腐处理是实现木材高附加值利用的重要途径[1]。目前，木材防腐的主要目标是开发出一种只对微生物有害，而对人兽无害、对环境无污染、对金属无腐蚀，以及综合性能优异的新型木材防腐剂[2-3]。中草药是天然环保型材料，选用中草药抑制木腐菌生长可解决环保问题，但是仍存在其他不足。首先，中草药的有效抑菌活性成分较少，且有效成分的提取工艺复杂，提取量少，降低了中草药的使用效率；其次，在中药提取过程中只提取了单一的有效成分，却忽视了其他有效成分的药用性，使资源得不到有效利用。因此，如何更方便高效地利用中草药是目前需要解决的首要问题。余园媛等[4]研究表明，黄连(CoptischinensisFranch.)对大量真菌有一定的抑制作用，且对腐蚀木材的彩绒革盖菌(Coriolusversicolor)有明显的抑制效果。黄连对木腐菌能够产生抑制作用主要是因为其内部的活性有效成分盐酸小檗碱和巴马丁[5]，但盐酸小檗碱只占黄连质量的6.88%～13.64%[6]。

为提高黄连的利用率，改善抑菌效果，减少用药量，节约有限的资源[7-8]，笔者将纳米技术应用到中草药防腐领域。中草药产生的药理效应不能仅归功于该药特有的化学组成，还与药物的物理状态密切相关[9]。纳米技术从改变中草药的粒径入手，直接解决其水溶性问题，避免了复杂的煎熬或提取工艺。纳米技术应用于中药可使中药物质核100%破壁，使其全部释放，取得最佳使用效果。

陈力等[10]对微纳米中药的制备方法进行了分析，结果表明，制备微纳米中药时不宜采用化学方法或制备工艺需要高温高压等苛刻条件的物理方法，这可以保留中草药原有的有效成分、化学结构及药效性。球磨法是一种普通的机械粉碎法，是国内外制备超细粉体运用较广的方法[11-13]。与普通球磨机相比，行星式球磨机在工作过程中会产生更高的能量，对物料产生的冲击与磨削作用更强[14]。因此，本试验利用变频行星式球磨机对黄连进行物理干法球磨，通过正交试验研究了球磨转速、球磨时间和小球数3个因素对微纳米黄连粒径及抑菌性的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

毛茛科植物黄连，购于呼和浩特市北域药房；试验菌种为白腐菌(彩绒革盖菌)，购于中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，后经实验室培养活化。

变频行星式球磨机，南京科析实验仪器研究所；WK-1200A型高速药物粉碎机，青州市精诚机械有限公司；LDZX-50KB型立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；BSA224S-CW型电子天平，精度0.1 mg，赛多利斯科学仪器有限公司；DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；HWS-250型恒温恒湿培养箱，金坛市精达仪器制造有限公司；ZHWY-1102型恒温培养摇床，金坛市精达仪器制造有限公司；N4-plus多角动态激光散射颗粒粒度测定仪，美国Coulter公司；Hitachi S-4800型场发射扫描电子显微镜，日本日立公司。

1.2 试验方法

1.2.1 微纳米黄连的制备

将同批次购买的黄连粉碎，过200目(75 μm)筛，绝干密封放置备用，采用物理干法球磨方法制备微纳米黄连。在不考虑交互作用条件下，对球磨转速、球磨时间、小球数3个球磨参数进行正交试验，采用L9(34)正交表进行9次试验，以菌落直径大小为评价指标进行抑菌性能分析，从而得出最佳生产工艺条件。正交试验设计见表1。

表1 正交试验设计

1.2.2 微纳米黄连的抑菌性能检测

将9次正交试验所制微纳米黄连分别编号为1～9，未研磨黄连作为对照组编号为10，空白组编号为11进行抑菌对比试验。将1～10号药末分别用水加热溶解制成10 mg/mL的药液，与马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)混合制成药液质量浓度为2 mg/mL的带毒培养基并对应编号。每一种带毒培养基设3个重复，另设3个空白组，于立式压力蒸汽灭菌器内121℃灭菌30 min。在无菌操作条件下将等量的菌体分别接种于培养皿，倒置放入恒温恒湿培养箱，于80%相对湿度、26℃下培养7 d，每天同一时刻用灭菌的游标卡尺采用十字交叉法测量各平板菌落直径。

1.2.3 最小抑菌质量浓度试验

选取抑菌效果最好的一组样品，分别称取17.5，35.0，70.0，350.0和700.0 mg样品倒入已备好的液体培养基中摇匀，分别配置为0.1，0.5，1.0，5.0和10.0 mg/mL 5个质量浓度的液体带毒培养基。每个质量浓度设3个重复，另设3个空白组，于立式压力蒸汽灭菌器内121℃灭菌30 min。在无菌操作条件下将同样大小的菌种接种于锥形瓶中，震荡使菌混合均匀并置于27℃、45 r/min的恒温摇床振荡培养7 d。每天同一时刻观察菌丝生长情况，培养第7天后用同种定性滤纸，将菌丝过滤后称出湿质量并记录。称量后将菌丝与滤纸一起置于鼓风干燥箱内，在80℃下烘至质量恒定，记录数据。

1.2.4 微纳米黄连结构与粒径检测

取少量样品，用适当的溶媒(水或乙醇)分散，滴取混悬液后自然干燥，然后粘台喷金，置于扫描电子显微镜(SEM)和显微粒度仪下观察微观结构。取适量样品，加入一定量的分散溶媒将样品分散制成 0.001～0.002 g/mL的混悬液，置于粒度分析仪中测定(测定前可进行超声分散)粒径分布。

2 结果与分析

2.1 微纳米黄连粒径分析

正交试验结果见表2。由表2可知，5号样品的抑菌圈直径仅为2.91 mm，抑菌效果最好。因此，本试验选取5号样品与随机抽选的抑菌效果一般的9号样品分别进行粒径检测。

5号和9号微纳米黄连粉体经SEM和显微粒度仪测定的微观形貌图分别见图1和图2。由图1a和图2a可以看出，5号粉体粒径小、多分散，主要形貌为块状与不规则球状。由图1b、1c和图2可以看出，5号粉体较9号粉体粒度分布更均匀，9号粉体的小颗粒多附着于大颗粒表面。5号粉体的宽度和长度多分布在200～700 nm，9号粉体的宽度和长度多分布在0.5～3.0 μm。结合抑菌试验结果可知，质量浓度相同的药液，颗粒粒径越小抑菌效果越好。

表2 正交试验和极差分析结果

注：Ki和ki分别为某因素的i水平对抑菌圈直径的总体和平均影响程度；R为某因素不同水平之间的极差。

图1 微纳米黄连的SEM图Fig. 1 SEM images of the micro-nano copits

图2 微纳米黄连的显微形貌图Fig. 2 Micrograph of the micro-nano copits

2.2 抑菌试验分析

微纳米和普通黄连粉体对白腐菌的抑菌作用见图3。由图3可以看出，11号菌落直径最大，这说明黄连对白腐菌有明显的抑制作用；1～9号菌落直径均小于10号，并且1～9号菌落直径从第3天到第7天的增长速度较10号更平缓；随着天数的增加，菌落的增长速率逐渐减小，从第6天到第7天时1～9号菌落直径基本无变化，而10号仍有增长，表明同一质量浓度的微纳米黄连较普通黄连的抑菌效果明显增强，抑菌周期减小。黄连抑制白腐菌生长主要是其内部的有效成分盐酸小檗碱和巴马丁的作用，而黄连中的有效成分需要经过溶剂的浸润、溶胀、渗透和分散才能溶出。对黄连本身而言，有效抑菌活性成分溶出主要受细胞壁、细胞膜和溶剂接触面积的影响。因此，当黄连经过研磨制成微纳米粉体后，药材中的细胞壁破碎，成分溶出不受细胞壁和细胞膜的阻碍，使得有效成分溶出量增多，并且缩短了溶剂进入颗粒中心的距离，加快了溶出速率，水溶性增强，从而表现出较普通黄连更强的抑菌性。除10号和11号粉体外，5号粉体的菌落最小，抑菌效果最好，7号粉体的菌落最大，抑菌效果最差，其他粉体表现出各不相同的抑菌效果。这是由于在不同条件下制备的粉体由于粒径不同，导致粉体破壁率不同，有效成分的溶出量不同，从而表现出不同的抑菌效果。微纳米黄连的粒径越小，比表面积越大，与溶出介质间的有效接触越大，水溶性越强，同时溶剂进入颗粒中心的距离越短，有效抑菌活性成分的溶出速率越大，从而使其更多更快地作用于白腐菌[15]。

图3 微纳米和普通黄连粉体对木材白腐菌的抑菌作用Fig. 3 Antimicrobial effects of micro-nano and normal copits on wood white-rot fungi

由表2可知，最优制备方案为球磨转速为280 r/min、球磨时间4 h、小球数60个，极差的绝对值由大到小依次为A、C、B。其中A因素影响最大，即首先要考虑球磨机转速，选280 r/min；其次要考虑C，即小球数为60个；最后考虑B，即球磨时间为4 h。这是因为在研磨过程中，研磨球由于其较大的惯性力而对物料产生强烈撞击，并且撞击力随着转速的增加成平方级增大，增加了给物料破碎提供的能量，但是当转速增加至330 r/min时，由于研磨球与物料的质量偏差太大，会导致两者产生的离心力差异过大而出现分层现象，减小了两者之间的接触。此外，研磨时间过长会对物料颗粒造成二次团聚，影响最终粒径。因此，球磨转速为280 r/min、球磨时间4 h、小球数60个是最佳球磨效果参数。

正交试验的方差分析见表3，因素A和C对试验结果都有非常显著的影响，其中因素A的影响最显著，而因素B对试验结果无显著影响。

表3 方差分析

注：*表示差异显著(P<0.05)。

2.3 最小抑菌质量浓度分析

图4 菌丝干质量随抑菌质量浓度变化趋势Fig. 4 Change trend of hypha dry mass as a function of antibacterial mass concentration

最佳条件下制备的微纳米黄连在不同质量浓度下抑制白腐菌生长的菌丝干质量变化趋势见图4。由图4可知，菌丝干质量随着微纳米黄连质量浓度的减小而逐渐增大，当质量浓度由10.0 mg/mL减小至5.0 mg/mL时，菌丝干质量变化较平缓；当质量浓度小于0.5 mg/mL时，菌丝干质量的增长幅度较大，抑菌效果明显减小；当质量浓度减小为0.1 mg/mL时，菌丝干质量与空白组接近，几乎没有抑菌效果。这是由于当质量浓度在10.0 mg/mL与5.0 mg/mL之间时，药液中的有效抑菌活性成分达到了抑菌水平；当质量浓度小于0.5 mg/mL时，有效抑菌活性成分不足以抑制菌种生长。根据最小抑菌质量浓度的定义可得，在球磨转速为280 r/min、球磨时间4 h、小球数60个的条件下制备的微纳米黄连最小抑菌质量浓度为0.5 mg/mL。

3 结 论

微纳米黄连的主要形貌为块状和不规则的球状，抑菌效果最佳的5号粉体粒度分布较抑菌效果一般的9号粉体更均匀，5号粉体的宽度和长度多分布在200～700 nm，9号粉体的宽度和长度多分布在0.5～3.0 μm。质量浓度相同的药液，颗粒粒径越小抑菌效果越好。不同条件下制备的微纳米黄连由于粒径的减小，有效抑菌成分的水溶性增强，溶出速率加快，较普通黄连表现出更明显的抑菌效果。通过菌落直径的比较确定微纳米黄连的最佳制备工艺条件为：球磨转速280 r/min、球磨时间4 h、小球数60个，在此条件下制得的微纳米黄连粒径均匀分布，颗粒为分散状，菌落直径仅为2.91 mm，抑菌效果最佳。当微纳米黄连抑菌质量浓度低于0.5 mg/mL时，抑菌效果急剧下降；当质量浓度降低至0.1 mg/mL时几乎没有抑菌效果。因此，微纳米黄连的最小抑菌质量浓度为0.5 mg/mL。

本研究初步证明了微纳米黄连较普通黄连的抑菌效果更强，下一步应该对微纳米黄连分子结构、微纳米黄连物质核破壁情况、微纳米与普通黄连的抑菌机理差异、粒径对抑菌效果的影响及最佳粒径范围等进行深入研究，为中草药防腐剂的高效利用提供借鉴。

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Preparation of micro-nano coptis and its antimicrobialactivity on white rot fungi

WANG Jie, ZHANG Zhenxin, WANG Yamei*

(College of Material Science and Art Design, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

To investigate the antifungal performance of the Chinese herbal medicine on wood, rhizoma coptis was used as a non-toxic and efficient raw material to prepare micro-nano coptis by the method of dry-ball milling. The effects of ball grinding time, ball grinding speed and ball number on the preparation of micro-nano copits were explored through the orthogonal test. The optimal preparation conditions were obtained by the comparison test of antifungal performance. The minimum antifungal mass concentration experiment determined the minimum fungi-static mass concentration of micro-nano coptis. The diameter distribution and morphology of nano-particles was examined by using the laser scattering particle size distribution analyzer and scanning electron microscopy (SEM) respectively. The results showed that the rhizoma coptis particles had more obvious fungistatic effect than the ordinary coptis did. The optimum parameters in the preparation of micro-nano coptis were as follows: the ball mill speed of 280 r/min, ball grinding time of 4 h and ball number of 60. The micro-nano coptis prepared in this condition were distributed with uniform particle size, and the bacteriostatic effect was the best. The minimum diameter of fungal colony was only 2.91 mm, and the minimum inhibitory mass concentration was 0.5 mg/mL. The results of SEM and microscope analysis showed that the main morphology of micro-nano copits was massive and irregular sphericity, and the particle size distribution was uniform and dispersive. Particle diameter and length were mostly ranged between 200 nm and 700 nm. Had the best bacteriostatic effect, No.5 powder particle size distributed more uniform than No.9 powder. The width and height of No.5 powder ranged between 200 nm and 700 nm, while those of No.9 powder were between 0.5 μm and 3.0 μm. Under the same solution concentration, the smaller particle had better bacteriostatic effect.

micro-nano; wood preservative; rhizoma coptis; dry ball milling; antifungal; white rot fungi

2016-08-17

2016-10-20

国家优秀青年科学基金(2014XYQ-13)。

王洁，女，研究方向为木材保护。通信作者：王雅梅，女，教授。E-mail:wangym80@126.com

S782.33

A

2096-1359(2017)02-0028-05