高佳，朱选风，张希龙，陆甘，刘剑南*

(1江苏省老年医院呼吸内科,南京 210024;2南京医科大学第一附属人民医院呼吸内科，南京 210000)

慢性间歇性缺氧(chronic intermittent hypoxia, CIH)是阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(obstructive sleep apnea syndrome,OSAS)的重要特征。许多研究报道CIH和心血管损伤[1,2]、颏舌肌损伤、肝脏损伤[3]等有密切关系。最近研究结果显示，在没有糖尿病和高血压的重症OSAS患者中，慢性肾脏疾病的发病率较高[4]。Sim等[5]发现，在早期肾病患者中，OSAS发病率较高[5]。因此，我们推测CIH可能会导致肾损伤。

内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是细胞为了应对过度刺激造成的内质网错误折叠及未折叠而产生的保护性反应。ERS通过IRE1、PERK、ATF6这三条通路调节。当内质网发生应激时，三条通路被激活，过度的内质网应激可以导致细胞凋亡[6-8]。X-框结合蛋白1(X-box binding protein 1)作为ER应激的重要价质，其有防止氧化应激的能力。同时，在动物和人的肾脏缺血再灌注过程中，ERS也被发现发挥重要作用[9，10]。

脂联素(adiponectin, Ad)是一个重要的脂肪因子，在人体内起到重要的保护作用。Cammisotto 等[11]发现，在远端肾小管组织中，Ad通过结合脂肪受体激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)而抑制糖原合成。另外，Ad是尿蛋白的重要调控因子，它激活AMPK通路，减少肾小球足细胞中Nox4的生成，从而调节氧化应激[12]。然而，Ad对CIH导致的肾脏损伤的保护作用目前并不清楚。本研究旨在观察CIH对肾脏的影响以及Ad的保护作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只成年Wistar大鼠(上海Silake公司)随机分为4组：正常对照(normal control, NC)组、NC+Ad组、CIH组和CIH+Ad组。依据参考文献[13]建立CIH大鼠模型。大鼠被饲养在设有空气控制器的特殊鼠笼里。2 min为1个循环，第1 min时控制氧浓度从21%降低到5%～6%，持续15～20 s；再接下来的1 min，控制氧浓度恢复到正常水平(21%)。CIH组和CIH+Ad组大鼠接受间歇性缺氧处理。其余组大鼠接受正常空气处理。同时NC+Ad 组和CIH+Ad组大鼠接受Ad(10 μg)尾静脉注射，每周2次。其余组大鼠接受生理盐水处理。间歇性低氧每天持续8 h，共4个月。

1.2 活性氧反应染色

新鲜大鼠肾脏组织包埋于乙醇干冰中获得最佳切割温度，制成8 μm的切片。接下来将切片浸没在10 μmol/L的超氧化物阴离子荧光探针(dihydroethidium，DHE)溶液中，37℃孵育30 min。在荧光显微镜下观察活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平。

1.3 细胞凋亡的末端脱氧核苷酸转移介导dUTP缺口末端标记染色检测

肾脏组织经过多聚甲醛固定48 h后，脱水、浸蜡。制成5 μm的石蜡切片。切片脱蜡脱水，使用蛋白酶K室温下孵育15 min。然后使用末端脱氧核苷酸转移介导dUTP缺口末端标记染色(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)反应液在37℃下处理切片 60 min。使用TUNEL-POD处理30 min后，分别使用3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine，DAB)和苏木素处理1 min。最后脱水封片，在光学显微镜下观察。随机选择5张病理切片评价肾脏细胞凋亡情况。

1.4 Western blotting

为反映各组大鼠内激网应激情况，Western blotting检测各组大鼠肾脏中GRP78、CHOP、IRE1、PERK、pro-ATF6蛋白的表达。取肾脏组织于裂解液(Thermo)中匀浆，10 000×g离心5 min，取上清使用BCA法进行蛋白定量。取等量蛋白在含有十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，电转移至聚偏氟乙烯膜上。将膜在封闭液中封闭1 h，然后浸入一抗中4℃过夜孵育。再与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育。最后使用ECL显色，X线放射自显影，扫描，拍片。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 ROS水平

与NC组和NC+Ad组比较，CIH处理后，ROS水平明显升高(P<0.05)。而给予Ad处理后，ROS水平明显下降，但仍然高于NC组和NC+Ad组(P<0.05)。NC组和NC+Ad组ROS水平差异无统计学意义(P>0.05；图1)。

图1 四组肾脏组织ROS水平Figure 1 ROS levels of renal tissue in four groupsA: ROS fluorescence staining(×400); B: densitometric evaluation. n=5. Compared with NC group, *P<0.05; compared with NC+Ad group, #P<0.05;compared with CIH group, △P<0.05

2.2 肾脏细胞凋亡

TUNEL染色显示，与NC组(0.5671%±0.1786%)和NC+Ad组(0.5207%±0.1589%)相比，CIH组(6.1510%±0.2797%)大鼠肾脏细胞凋亡明显增加(P<0.05)。而给予脂联素补充后，肾脏细胞凋亡明显减少(4.0590%±0.2454%)，但仍然高于NC组和NC+Ad组(P<0.05)。NC组和NC+Ad组之间差异无统计学意义(P>0.05；图2A，2B)。与NC组和NC+Ad组相比，CIH组和CIH+Ad组caspase-12和caspase-3蛋白水平(图2C，2D)明显增加(均P<0.05)。而CIH组仍然高于CIH +Ad组(P<0.05)。NC组和NC+Ad组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 内质网应激

与NC组和NC+Ad组相比，CIH组大鼠肾脏组织的GRP78和CHOP蛋白水平明显增加(P<0.05；图3)，而CIH组大鼠给予脂联素补充后，GRP78和CHOP蛋白水平明显减少，但仍然高于NC组和NC+Ad组(P<0.05)。NC和NC+Ad组间差异无统计意义(P>0.05)。与NC组和NC+Ad组相比，CIH组大鼠肾脏组织的IRE1(图4)和PERK(图5)通路蛋白水平明显增加(P均<0.05)，给予脂联素补充后，IRE1和PERK通路蛋白水平明显减少，但仍然高于NC组和NC+Ad组(P<0.05；图6)。CIH组的pro-ATF6蛋白表达水平低于NC组、NC+Ad组和CIH+Ad组(P<0.05)，而CIH组pro-ATF6蛋白表达水平则低于NC组和NC+Ad组，三条内质网应激通路蛋白水平在NC组和NC+Ad组间差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

OSAS是一种慢性全身性疾病。Fleischmann等[14]发现睡眠呼吸障碍患者高发慢性肾脏病3期。Kawakami等[9]研究也发现在睡眠呼吸障碍的病人中慢性肾脏病相对比较高。因此我们推测OSAS可能在慢性肾脏病的病程发展中起重要作用。在本研究中，我们发现长期的CIH虽然没有导致肾脏功能的损伤，但是肾脏细胞凋亡明显增加。经过CIH处理，肾脏凋亡细胞及细胞凋亡生物标志物caspase-3蛋白水平升高，这可能是CIH造成肾脏损害的机制之一。而给予脂联素后，细胞凋亡明显减少。因此，我们发现Ad对CIH导致的肾脏损伤具有保护功能。为了评估Ad在肾脏细胞凋亡时起保护作用的机制，我们研究了ERS的蛋白水平变化。在本实验中，ERS的两种生物标志物GRP78和CHOP水平均明显升高，由此证实CIH激活了ERS。尽管ERS开始时是一种保护性反应，但是越来越多证据表明，过度的ERS会导致细胞凋亡[6,7,15-17]。

图2 四组肾脏细胞凋亡情况检测Figure 2 Renal cell apoptosis in four groups

A: TUNEL staining (× 400); B: densitometric evaluation; C: Western blotting; D: densitometric evaluation.n= 5. Compared with NC group,*P<0.05; compared with NC+Ad group,#P<0.05; compared with CIH group,△P<0.05

图3 四组肾脏组织GRP78和CHOP蛋白表达水平Figure 3 Expression of GRP78 and CHOP of renal tissue in four groupsA: Western blotting; B: densitometry evaluation. n=3. Compared with NC group, *P<0.05; compared with NC+Ad group, #P<0.05; compared with CIH group, △P<0.05

图4 四组肾脏组织IRE1通路蛋白表达水平Figure 4 Expression of IRE1 pathway proteins of renal tissue in four groupsA: Western blotting; B: densitometry evaluation. n=3. Compared with NC group, *P<0.05; compared with NC+Ad group, #P<0.05; compared with CIH group, △P<0.05

图5 四组肾脏组织PERK通路蛋白表达水平Figure 5 Expression of PERK pathway proteins of renal tissue in four groupsA: Western blotting; B: densitometry evaluation. n=3. Compared with NC group, *P<0.05; compared with NC+Ad group, #P<0.05; compared with CIH group, △P<0.05

图6 四组肾脏组织pro-ATF6蛋白表达水平Figure 6 Expression of pro-ATF6 protein of renal tissue in four groupsA: Western blotting; B: densitometry evaluation.n=3. Compared with NC group, *P<0.05; compared with NC+Ad group, #P<0.05; compared with CIH group, △P<0.05

ERS有3条通路:IRE1、PERK、ATF6。任何一条通路活化最终都能激活CHOP基因表达[18-20]，最终导致细胞凋亡[21]。在本研究中，CIH组三条通路均被激活，IRE1、PERK蛋白水平升高，而pro-ATF6蛋白水平降低，CHOP的蛋白水平亦明显升高。另外，caspase-12是ERS相关细胞凋亡的特异性分子[22]。CIH组的caspase-12蛋白水平明显上升。本研究结果提示，ERS会导致肾脏细胞凋亡；给予Ad处理后，IRE1、PERK、CHOP、caspase-12蛋白水平降低，而pro-ATF6蛋白水平升高。最终发现，脂联素通过抑制ERS起到保护肾脏的作用。

目前，很多研究已证实CIH可以使ROS水平升高[23，24]。本研究也发现CIH组的ROS蛋白水平明显升高。另外，越来越多的证据表明，ROS可引起ERS[25,26]。本研究亦发现ROS是CIH引起内质网应激的一个重要中介物，给予Ad治疗的CIH组，ROS的水平明显降低，从而证实抑制ROS生成或许是Ad能够保护肾脏的重要机制。

综上所述，本研究发现脂联素可通过抑制CIH导致的ROS，进而抑制ERS相关的肾脏细胞凋亡。

【参考文献】

[1] Inamoto S, Yoshioka T, Yamashita C,etal. Pitavastatin reduces oxidative stress and attenuates intermittent hypoxia-induced left ventricular remodeling in lean mice[J]. Hypertens Res, 2010, 33(6): 579-586. DOI: 10.1038/hr.2010.36.

[2] Zhou W, Li S, Wan N,etal. Effects of various degrees of oxidative stress induced by intermittent hypoxia in rat myocardial tissues[J]. Respirology, 2012, 17(5): 821-829. DOI: 10.1111/j.1440-1843.2012.02157.x.

[3] Hernandez-Guerra M, de Ganzo ZA, Gonzalez-Mendez Y,etal. Chronic intermittent hypoxia aggravates intrahepatic endothelial dysfunction in cirrhotic rats [J]. Hepatology, 2013, 57(4): 1564-1574. DOI: 10.1002/hep.26152.

[4] Chou YT, Lee PH, Yang CT,etal. Obstructive sleep apnea: a stand-alone risk factor for chronic kidney disease[J]. Nephrol Dial Transplant, 2011, 26(7): 2244-2250. DOI: 10.1093/ndt/gfq821.

[5] Sim JJ, Rasgon SA, Kujubu DA,etal. Sleep apnea in early and advanced chronic kidney disease: Kaiser Permanente Southern California cohort[J]. Chest, 2009,135(3): 710-716. DOI: 10.1378/chest.08-2248.

[6] Hetz C. The unfolded protein response: controlling cell fate decisions under ER stress and beyond[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012, 13(2): 89-102. DOI: 10.1038/nrm3270.

[7] Grimm S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death[J].Biochim Biophys Acta, 2012, 1823(2): 327-334. DOI: 10.1016/j.bbamcr.2011.11.018.

[8] Bravo R, Gutierrez T, Paredes F,etal. Endoplasmic reticulum: ER stress regulates mitochondrial bioenergetics[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2012, 44(1): 16-20. DOI: 10.1016/j.biocel.2011.10.012.

[9] Kawakami T, Inagi R, Takano H,etal. Endoplasmic reticulum stress induces autophagy in renal proximal tubular cells[J]. Nephrol Dial Transplant, 2009, 24(9): 2665-2672. DOI: 10.1093/ndt/gfp215.

[10] Mahfoudh-Boussaid A, Zaouali MA, Hadj-Ayed K,etal. Ischemic preconditioning reduces endoplasmic reticulum stress and upregulates hypoxia inducible factor-1alpha in ischemic kidney: the role of nitric oxide[J]. J Biomed Sci, 2012, 19: 7. DOI: 10.1186/1423-0127-19-7.

[11] Cammisotto PG, Londono I, Gingras D,etal. Control of glycogen synthase through ADIPOR1-AMPK pathway in renal distal tubules of normal and diabetic rats[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2008, 294(4): F881-F889. DOI: 10.1152/ajprenal.00373.2007.

[12] Sharma K, Ramachandrarao S, Qiu G,etal. Adiponectin regulates albuminuria and podocyte function in mice[J]. J Clin Invest, 2008, 118(5): 1645-1656. DOI: 10.1172/JCI32691.

[13] Ding W, Zhang X, Huang H,etal. Adiponectin protects rat myocardium against chronic intermittent hypoxia-induced injuryviainhibition of endoplasmic reticulum stress[J]. PLoS One, 2014, 9(4): e94545. DOI: 10.1371/journal.pone.0094545.

[14] Fleischmann G, Fillafer G, Matterer H,etal. Prevalence of chronic kidney disease in patients with suspected sleep apnea[J]. Nephrol Dial Transplant, 2010, 25(1): 181-186. DOI: 10.1093/ndt/gfp403.

[15] Tabas I, Ron D. Integrating the mechanisms of apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress[J]. Nat Cell Biol, 2011, 13(3): 184-190. DOI: 10.1038/ncb0311-184.

[16] Jing G, Wang JJ, Zhang SX. ER stress and apoptosis: a new mechanism for retinal cell death[J]. Exp Diabetes Res, 2012, 2012: 589589. DOI: 10.1155/2012/589589.

[17] Shore GC, Papa FR, Oakes SA. Signaling cell death from the endoplasmic reticulum stress response[J]. Curr Opin Cell Biol, 2011, 23(2): 143-149. DOI: 10.1016/j.ceb.2010.11.003.

[18] Rubio C, Pincus D, Korennykh A,etal. Homeostatic adaptation to endoplasmic reticulum stress depends on Ire1 kinase activity[J]. J Cell Biol, 2011, 193(1): 171-184. DOI: 10.1083/jcb.201007077.

[19] Rasheva VI, Domingos PM. Cellular responses to endoplasmic reticulum stress and apoptosis[J]. Apoptosis, 2009, 14(8): 996-1007. DOI: 10.1007/s10495-009-0341-y.

[20] Schroder M. Endoplasmic reticulum stress responses[J]. Cell Mol Life Sci, 2008, 65(6): 862-894. DOI: 10.1007/s00018-007-7383-5.

[21] Marciniak SJ, Yun CY, Oyadomari S,etal. CHOP induces death by promoting protein synthesis and oxidation in the stressed endoplasmic reticulum[J]. Genes Dev, 2004, 18(24): 3066-3077. DOI: 10.1101/gad.1250704.

[22] Nakagawa T, Zhu H, Morishima N,etal. Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-beta[J]. Nature, 2000, 403(6765): 98-103. DOI: 10.1038/47513.

[23] Chen L, Einbinder E, Zhang Q,etal. Oxidative stress and left ventricular function with chronic intermittent hypoxia in rats[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2005, 172(7): 915-920. DOI: 10.1164/rccm.200504-560OC.

[24] Wang Y, Zhang SX, Gozal D. Reactive oxygen species and the brain in sleep apnea[J]. Respir Physiol Neurobiol, 2010, 174(3): 307-316. DOI: 10.1016/j.resp.2010.09.001.

[25] Ding W, Yang L, Zhang M,etal. Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress contributes to aldosterone-induced apoptosis in tubular epithelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 418(3): 451-456. DOI: 10.1016/j.bbrc.2012.01.037.

[26] Liu ZW, Zhu HT, Chen KL,etal. Protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) signaling pathway plays a major role in reactive oxygen species (ROS)-mediated endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in diabetic cardiomyopathy[J]. Cardiovasc Diabetol, 2013, 12: 158. DOI: 10.1186/1475-2840-12-158.