娄序笙，胡京红，葛东宇，鲁卫星△

1. 北京中医药大学第三附属医院心血管内科(北京100029),2.北京中医药大学中医学院科研实验中心(北京100029)

金银花对病毒性心肌炎小鼠血清心肌酶的影响*

娄序笙1，胡京红2，葛东宇2，鲁卫星1△

1. 北京中医药大学第三附属医院心血管内科(北京100029),2.北京中医药大学中医学院科研实验中心(北京100029)

目的： 探讨金银花对于CVB3 病毒感染小鼠心肌损伤模型的保护作用。方法：将CVB3病毒在HeLa细胞培养基中培养，一段时间后测定细胞的半数感染量，将CVB3病毒培养液接种在小鼠腹腔内，借此创建VMC模型。小鼠随机分为正常对照组，模型组，金银花低剂量组、金银花高剂量组，灌胃给药3周。应用酶联免疫法检测各组感染小鼠体内3 种心肌酶(磷酸肌酸激酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶)在血清中的释放量;并将其心肌组织进行HE染色，观察其形态学病理变化。结果：金银花低剂量组、高剂量组对于血清LDH、AST、CK含量具有明显抑制作用(P<0.05)，金银花能减小心肌炎症对周围的浸润范围，有效抑制心肌炎病情的恶化，保护心肌组织。结论：金银花可以有效抑制机体内VMC 病毒的扩散, 对防治感染程度较轻的小鼠VMC具有一定的效果。

病毒性心肌炎(Viral myocarditis ,VMC) 系病毒在临床上主要会诱发心肌局灶性或弥漫性病变,而感染范围最大的嗜心肌病毒为柯萨奇B3 病毒(CVB3)[ 1-2 ]。柯萨奇B3 病毒感染以心衰和心律失常为主要的临床表现,心肌炎症多属于慢性疾病，严重者可引起扩张型心肌病。 VMC发病有增多趋势,尤其在儿童及青壮年中发病率高。现阶段，治疗VMC多以采取支持疗法和综合疗法为主,包括辅酶Q10治疗、补充维生素 C、抗病毒、免疫调节、营养心肌等。但西药治疗VMC存在费用高、副作用大、疗效不确切的缺点，虽有成效，效果却差强人意。目前临床上尚未研发出治疗VMC的特效药，也无有效的治疗手段。最新研究成果表明，对VMC采用中药疗法具有一定的效果,因此寻找并提取中药中抗CVB3 的有效活性成分,成为治疗VMC 的最新趋势[ 3-4 ]。

金银花为忍冬科Caprifoliaceae 植物忍冬Lonicera japonica Thunb等的干躁花蕾或带初开的花[1]，其制剂味甘、性寒，主要经入肺、胃、大肠经发挥疗效。通常采自其尚未完全开放的花蕾，经晾后炒用，是一味常见中药材，具有清热解毒，疏散风热之功效，金银花可冲泡亦可煎汁服用，自古以清热解毒之良药广为称道,其水煎剂对很多病毒均有一定的抑制作用。例如，将比例为1∶20的金银花水煎剂用于人体肾原上皮细胞的组织培养，可抑制疱疹病毒和流感病毒的复制与扩散。本文拟探讨金银花对病毒性心肌炎小鼠血清心肌酶的影响。

材料与方法

1 材 料

1.1 将CVB3Nancy病毒株设为标准株, 置于-80 ℃冰箱中保存, 实验前活化病毒，并在HeLa 细胞中至少进行3 次传代冻融,将复苏增殖后的病毒用Reed-Muench 微量法滴定,实验用100 T CID50/ ml的滴度。

1.2 药品与试剂：采用南京建成生物工程研究所生产的血清肌酸激酶测定试剂盒(产品批号20041012)、乳酸脱氢酶测定试剂盒(产品批号20041013)与天冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒(产品批号20041017)中药金银花购自北京中医药大学第三附属医院中药房，药品批号1102023，金银花煎液:将中药房金银花常规煎煮3次,过滤去渣,混合,再浓缩配成0. 5kg/L 和1 kg/L的煎液。

1.3 动物与仪器：纯种BALB/ c 小鼠,雄性,鼠龄4～6周,体重14～16g ,饲养于北京中医药大学基础实验动物中心SPF 级饲养室。

实验仪器：电子天平，日本东京A&D company，型号ER-182A；全自动生化分析仪，日立公司，型号7600；低温离心机，德国Eppendorf AG 型号：centrifuge5810 R； Tecan Safire2型自动酶联免疫测定仪，瑞士TECAN公司。

2 方 法

2.1 动物分组及给药：随机取180只实验小鼠分成四组，每组45只，分别设为金银花低剂量组、高剂量组、模型对照组和正常对照组，除正常对照组外每组小鼠每只腹腔无菌注射 0.1 ml 1. 0 ×10-5CVB3病毒 , 诱导小鼠VMC 模型,在隔离实验室饲养。正常对照组小鼠每只腹腔无菌注射不含CVB3的MEM Eagle’s 液0.1 ml，饲养于常规实验室。接种病毒0.5小时采用灌胃法给药，金银花低剂量组以0. 5 kg/L 金银花煎液灌胃;金银花高剂量组以1 kg/L的金银花煎液灌胃; 模型对照组及正常对照组均以1 kg/L生理盐水灌胃。各组按0.025 ml /g灌胃, 1次/d,连续21d。每组于接种病毒后7d、14d、21d处死。取心脏和血清标本。

2.2 一般观察：观察记录实验期间动物的兴奋性，粪便情况，进食进水量，毛发状态和呼吸系统、神经系统、循环系统等生理状况，并统计小鼠死亡数量。

2.3 血清心肌酶测定:接种病毒时间定为第0天，至第7天、第14天、第21天时随机从各组取15只小鼠，于眼眶采血后处死小鼠留取心脏，将血1 500 r/min 离心15 min ,收血清采用HITACHI-7600全自动生化分析仪测定3 种心肌酶(磷酸肌酸激酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶)在血清中的释放量。按试剂盒说明书操作。

2.4 组织病理学检查:各组小鼠处死后留取心脏，称重后沿左心室长轴切开，用10%甲醛固定后石蜡包埋切片，对组织切片进行HE染色,并观察组织损伤、炎性细胞浸润及心肌细胞损伤的程度。

3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件，两组计量结果比较采用t检验，计数资料比较用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 小鼠一般状态观察，在活动度、毛色及造模后开始死亡的最早时间方面，金银花治疗组明显好于模型组,两组金银花治疗组之间比较,差别不明显,见表1。

表1 各组小鼠总实验数整体观察记录

注：活动度：话动频繁，攀笼；话动，攀笼少；活动．有蜷缩；+活动少，蜷缩。毛色：光滑致密；偶见疏松；+疏松不泽

2 各组小鼠血清心肌酶CK、AST、LDH含量测定结果 各组小鼠在第7天、第14天、第21天模型对照组与正常对照组比较，CK、AST、LDH含量均升高，金银花治疗组与模型对照组比较，以上指标含量均降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)，而金银花治疗进行组间比较，结果无统计学差异(P>0.05),见表2。

表2 各组小鼠第7天、第14天、第21天血清心肌酶CK、AST、LDH含量测定结果(U/L)

注：与正常对照组比较，*P<0.05;与模型对照组比较，△P<0.05

3 心肌组织病理学观察 3.1 HE染色显示：模型对照组，小鼠心肌细胞从第7天出现肿胀，胞质染色嗜酸性增强，细胞横纹模糊，以及间质炎细胞浸润，核碎裂的病理变化。第14天病理检测结果示部分心肌细胞的胞质染色嗜酸性增强、均质化。心肌组织坏死范围加大，炎性细胞浸润加重，出现心肌细胞边界模糊，心肌组织严重出血的现象，病理变化达最高峰；第21天病理检测示炎性病灶开始吸收，代之以纤维化。金银花治疗组，第7、14天心肌细胞轻度变性，周围有散在炎细胞浸润；心肌细胞变性坏死程度比模型对照组减轻；第21天心肌细胞固缩，坏死，纤维化少见。金银花治疗组心肌炎症及坏死程度减轻。见图1。

图1 各组心肌组织病理学观察 (HE染色,40×)

中医文献中对于VMC的命名并无明确的记载，在《国标·中医临床诊疗术语疾病部分》中的记载中有名为“心瘅”的疾病，临床表现和发病机理与VMC相似，也有一些学者将本病归到“胸痹”“心悸”的范畴。本实验结果说明金银花能使心肌酶浓度下降，可保护心肌细胞免受损伤。本次研究主要检测存在于心肌酶中的CK-MB、CK及LDH的含量。CK在动物的肌肉、心脏及脑组织中广泛存在，在人体能量代谢中发挥重要的作用。CK在VMC病发过程中最早出现并迅速升高，是检测心肌损伤程度的指标。CK存在于心肌中的同工酶CK-MB 也可以反映心肌损伤程度，可借此对心肌损害进行早期早期诊断。LDH是一种糖酵解酶，在机体组织细胞的胞质内广泛存在，其中在肾脏含量较高。

金银花治疗后小鼠心肌标本采样病理评分较模型对照组下降明显，金银花高剂量组比金银花低剂量组病理评分下降明显，证明金银花可有效保护心肌细胞结构及功能，减轻病毒感染的破坏程度。上述实验结果表明金银花对VMC小鼠有很好的治疗作用，为进一步提取有效成分打下基础。

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(收稿：2016-11-09)

Effect of honeysuckle on serum myocardial enzyme in mice with viral myocarditis

Lou Xusheng，Hu Jinghong，Ge Dongyu，et al.

Department of Cardiology,The 3rd Hospital Affiliated Beijing University of Chinese Medicine (Beijing 100029)

Objective：To investigate the protective effect of honeysuckle on the myocardial injury model of CVB3 virus infection in mice . Methods: CVB3 virus was cultured in HeLa cell culture medium. After a period of time, the amount of half of the cells was measured. The CVB3 virus was inoculated into the abdominal cavity of mice, which was created by VMC. The mice were randomly divided into normal control group, model group, low dose group and high dose group of honeysuckle, and 3 weeks of administration of the drug. Mice were detected by enzyme-linked immunosorbent assay in 3 infected myocardial enzymes (creatine kinase and aspartate aminotransferase, lactate dehydrogenase) release in the serum were collected;and the myocardial tissue HE staining to observe the morphological and pathological changes. Results:The honeysuckle low dose group and high dose group has obvious inhibitory effect on serum LDH, AST and CK content (P< 0.05), can reduce the inflammatory infiltration of honeysuckle in the surrounding area, effectively inhibit the deterioration of myocarditis condition, myocardial protection.Conclusion:It has been demonstrated that honeysuckle could control the activities about LDH , AST , and CK,have potent antivirus activities against CVB3 in vivo.

Myocarditis/traditional chinese medicine thearpy Flos Lonicerae Japonicae Adenoviruses Animal experimentation Mice

*北京中医药大学中青年教师资助项目(2011JYBZZJS-030)

心肌炎/中医药疗法 金银花 病毒 动物实验 小鼠

R542.21

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.04.062

△通讯作者