李娟　伦涵宁　李曼　付鹏程

【摘 要】为在分子水平上研究豫西枣品种遗传结构，揭示品种分化与野生种的亲缘关系，本研究选取豫西两个枣品种和一个野生酸枣群体共48份种质为材料，采用20对SSR引物，研究野生酸枣与品种的遗传结构。三个群体在遗传组成上被分為3组，群体间的界限清晰。野生酸枣与两个枣品种间的基因流是不对称的，主要是酸枣和灰枣流向扁核酸。扁核酸虽然遗传多样性低，但与其他群体的基因交流频繁。本研究所用SSR标记及方法可用于不同枣品种的遗传结构分析，为研究酸枣与枣种质资源间的群体进化提供了借鉴。

【关键词】酸枣；枣品种；基因流

0 前言

枣Ziziphus jujuba Mill.和酸枣Z.acidojujuba C.Y.Cheng et M.J.Liu[1]同为鼠李科枣属植物，为该属枣组中仅有的两个种。枣在我国具有至少3000年的栽培历史，其果实营养丰富，是我国重要的果树，同时还能防风固沙、保持水土，是优良的生态经济型树种[2]。酸枣原产我国，为栽培枣的原生种。枣与酸枣的种质资源极为丰富，分布广泛，已知的枣品种有800多个，以及众多的酸枣品种[2-3]。

枣和酸枣间的亲缘关系研究由来已久。对枣及其近缘种酸枣的形态学、花粉学及同工酶谱等多方面的比较研究，结合化石、出土文物和古文献考证及实地调查，认为枣和酸枣均原产我国，黄河中下游一带是枣的原产地和最早的栽培中心[4]。另外，鉴于自然界存在有酸枣向枣连续演进的过渡型如大酸枣等，支持枣起源于野生酸枣，是我国古代人民经过长期人工选种和栽培逐渐演化而来[2，5]。

微卫星（SSR）因为具有多态性高、共显性、可靠性高等优点，已越来越多的用于物种形成与演化的研究[6]，对种性复杂的枣树更是良好的分子标记。目前针对枣已开发了大量的SSR标记用于枣品种的系统发育关系重建[7-12]。此外，酸枣的遗传多样性和遗传结构已有研究[13]，但缺少酸枣与枣演化关系的研究。

为进一步阐明枣品种分化与野生种的亲缘关系，本研究以豫西部分枣品种为例，揭示野生酸枣与枣品种的遗传结构与基因流，为枣亲缘关系研究及资源利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在洛阳及周边地区采集酸枣、灰枣和扁核酸样本，每株分别取幼叶用硅胶干燥，共采集酸枣14个，灰枣和扁核酸各17个。

1.2 DNA提取、PCR扩增与毛细管电泳

针对枣叶片中多糖含量高等特点，采用改良的CTAB法从叶片中提取总DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。使用20对SSR荧光引物[14]对样品进行PCR扩增，扩增体系与扩增条件与Fu et al.[14]中描述相同。PCR扩增产物在武汉擎科生物技术有限公司A3730xl测序仪上进行毛细管电泳，在软件Gene Marker v1.71中读取条带数据。

1.3 数据分析

1.3.1 遗传多样性

用Micro-Checker 2.2.3[15]检查数据的正确性，纠正读带错误，消除回声斑（stuttering），同时检测无效等位位点（null alleles）。用Genepop 4.0.10.[16]计算等位基因数目、期望杂合度Ho（Expected heterozygosity）、观测杂合度He（observed heterozygosities），并检测哈迪温伯格平衡（Hardy-Weinberg test）与连锁不平衡（linkage disequilibrium）（1，000次重复）。

1.3.2 遗传分组

采用软件STRUCTURE v2.3.2[17]对所有个体进行遗传分组。STRUCTURE采用贝叶斯聚类方法，可以评估不同类群间基因流的方向，并为同域分布居群的混合提供证据。运算枣群体数据时，将分组数K值设置为1-5，每个K值运行10次重复，每个重复运行1000，000代，前100，000代（10%）作为burn-in舍弃。最佳K值通过Ln值（Pritchard et al.，2000）与ΔK值[18]的变化曲线确定，拐点处对应的K值即为最佳K值。然后将最佳K值对应的10次重复运行的结果在软件CLUMPP 1.1.2[19]中计算平均值，计算采用Greedy比对方法，运行10，000次重复。随后在软件DISTRUCT 1.1[20]中将分组结果画图。

2 实验结果

2.1 遗传多样性

在酸枣群体中，20个SSR位点的均等位基因数为8.7，在扁核酸群体平均等位基因数为4.3，灰枣群体平均等位基因数为5.3。酸枣群体的观测杂合度与期望杂合度均最高，灰枣次之，扁核酸最低。酸枣、扁核酸和灰枣群体中分别有3、13和13个位点偏离哈迪-温伯格平衡（P<0.01）。

2.2 遗传分化

用STRUCTURE分组后，Ln值随着K值的变化在K=3时出现拐点，ΔK值随着K值的变化也在K=3时出现明显的拐点（图1），因此将枣群体分为3组；并据此将所有个体按STRUCTURE结果进行分组，结果如图2。三个群体整体上可以被分开，群体间的界限清晰，仅在一个居群中存在错位。在三组分类的基础上，一些混合的个体可以解释为渗入。野生酸枣与两个枣品种间的渗入是不对称的，均为酸枣流向枣品种，且流向扁核酸的大于灰枣。两个枣品种间的渗入也是不对称的，更多的是从灰枣向扁核酸渗入。

3 讨论

经过长期的人工选育，枣品种已形成了独特而稳定的遗传组成，本研究中野生酸枣、扁核酸和灰枣三者间存在明显的遗传聚类。基于ISSR分子标记对河南主栽枣品种进行了遗传关系分析表明灰枣与扁核酸聚为一类，亲缘关系较近[21]。从遗传分组结果看，扁核酸在遗传组成上比灰枣保留了更多的酸枣痕迹，说明与灰枣相比，扁核酸与酸枣的亲缘关系更近。如果遵循栽培枣由野生酸枣驯化而来的假说，扁核酸有可能是在灰枣之前被选育的。

本研究的结果表明，酸枣、灰枣与扁核酸间存在一定的基因流。虽然有研究表明河南枣主栽品种与灰枣的总群体间分化程度较高，群体间基因交流较少[22]，但基因流的方向未知。本研究基于SSR标记的结果表明，灰枣与扁核酸间的基因流方向是不对称，主要是由灰枣流向扁核酸，这种基因交流能提高扁核酸群体的遗传多样性，但同時也会减少不同枣群体间的遗传分化，增加不同枣种质资源的相似程度。已有研究表明不同地理环境在枣品种的群体进化中发挥了较重要的作用，但有些品种由不同区域间品种经过频繁的基因交流和重组选育而来，没有明显区域特征[12]。虽然三个群体中扁核酸的遗传多样性是最低的，由于基因流的作用，其遗传组成中外来成分的比例是最高的。

本研究所用SSR标记可以对不同枣品种进行清晰的遗传聚类，为枣的群体进化提供了可选工具。此外，本研究所用SSR标记及方法可用于不同枣品种的遗传结构分析，为研究酸枣与枣种质资源间的演化关系提供了借鉴。

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[责任编辑：田吉捷]