王红雷，韩延辉，贾静静，来利红，朱继红，董平栓

(河南科技大学第一附属医院心血管内科，洛阳 471003)

经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)是目前治疗急性心肌梗死(acute myocardial infarction，MI)的最有效手段[1,2]。然而开通血管后，虽然消除了血管的机械性阻塞，但远端的分支及末端微血管并未得到有效灌注[3]，各分支血管供应的心肌组织仍处于缺氧状态，甚至开通血管后，梗死面积进一步扩大，即PCI术后的缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，IRI)[4]。IRI的发生减少了血运重建带给患者的益处。再灌注阶段活性氧类(reactive oxygen species，ROS)的爆发以及随后发生的细胞凋亡是IRI发生重要因素。冠状动脉分支末梢的心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMEC)是血管与心肌细胞之间的第1道屏障，在IRI发生时最早受到影响[5,6]。因此，在防治PCI术后的二次打击中，降低IRI诱导的CMEC氧化应激损伤起到至关重要的作用。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是由肠道内分泌细胞分泌的肠促胰岛素，可被二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)迅速降解[7,8]。艾塞那肽(exenatide，Exe)是GLP-1受体激动剂，能更好地耐受DPP-4降解，使低血糖事件发生率降低[9]。此外，Exe还具有减少心肌梗死面积、抑制心肌细胞凋亡等作用[10,11]。但Exe对IRI诱导的CMEC氧化应激损伤的保护机制尚未完全明确。因此，我们通过建立体外缺氧复氧模型(hypoxia/reoxygenation model，H/R)，探究氧化应激损伤诱导CMEC凋亡的信号通路及Exe的保护机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)(Santa Cruz，上海)，一抗黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)(1∶1000，Abcam，上海)，β-actin(1∶2000，Santa Cruz，上海)，Fura-3AM荧光探针试剂盒和DCFH-DA荧光探针试剂盒(Molecular probe，美国)，JC-1染色试剂盒(碧云天，上海)。共聚焦显微镜(OLYMPUS DX51，日本)，酶标仪(Epoch 2，美国)。

1.2 CMEC的提取及鉴定

在文献基础上进行改良[12]。5只5～6 d的SD大鼠处死后取出左心室，75%乙醇中浸泡15 s，清洗后剪碎，采用I型胶原酶和胰蛋白酶37℃水浴消化10 min，离心后重悬于培养液中，培养4 h，去除悬浮未贴壁的细胞。细胞固定封闭后，分别滴加Ⅷ因子多克隆抗体和CD31单克隆抗体(均为1∶100)，孵育过夜。倒置荧光显微镜观察，计数3个视野及均数。

1.3 H/R模型的建立以及Exe干预

CMEC缺氧处理4 h，换氧含量正常的复箱放置4 h，建立H/R模型。为了考察Exe对H/R模型的影响，分别5组：正常对照组、H/R模型组、1 nmol/L Exe组、10 nmol/L Exe组和100 nmol/L Exe组。采用完全培养基[20%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)+高糖DMEM)]， 37°C、5% CO2条件下放置12 h。

1.4 Ca2+和siRNA干扰技术对H/R模型的影响

1.4.1 Ca2+对XO表达量的影响 采用Western blotting检测XO的表达量。分为5组：正常对照组、H/R 模型组、H/R+Exe组、H/R+BAPTA组和H/R+Iono组。其中BAPTA为胞浆Ca2+螯合剂，而Iono为胞浆Ca2+激活剂。

1.4.2 siRNA干扰技术对ROS的影响 为证实XO是胞浆过量ROS的主要来源，采用2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针检测各组胞浆ROS荧光强度，分为5组：正常对照组、H/R模型组、H/R+Exe组、H/R+siRNA组和H/R+siRNA对照组。其中H/R+siRNA组采用siRNA干扰技术敲低XO蛋白。将SD大鼠XO的siRNA序列修改为5’-CCACCUCCAAGAUUCAUAUTT-3’。CMEC细胞培养至80%融合，梯度更换低浓度血清培养基，培养24 h并同步化细胞。加入Lipo2000 和对应的siRNA，确定最终转染时间。XO表达的抑制时间为48 h。

1.5 ROS对线粒体结构和功能的影响

分为6组：正常对照组、H/R模型组、H/R+Exe组、H/R+siRNA组、H/R+siRNA对照组和H/R+N-乙酰半胱氨酸(NAC)组。其中NAC为胞浆ROS清除剂。

1.5.1 JC-1染色 依据JC-1染料在正常细胞线粒体中为红色荧光、而在受损线粒体中为绿色荧光的特质，考察ROS对线粒体结构和功能的影响。各组中添加JC-1 染料于37℃条件下孵育30 min，荧光显微镜下拍照。Jmage Pro软件荧光半定量检测膜电位。使用四甲基若丹明乙酯酸铵染料，于细胞处理结束后，添加染料与细胞共同孵育30 min，随后用酶标仪测定520 nm 处吸光度值(A520 nm)，计算相对值为膜孔道开放程度。

1.5.2 细胞色素-C释放 细胞色素-C(cytochrome-C, Cyt-C)释放是线粒体膜电位受损、膜孔道开放比例增加的结果。在培养板中将已爬好细胞的玻片用4%的多聚甲醛固定爬片15 min；0.5% Triton X-100室温通透20 min；在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；吸水纸吸掉封闭液，滴加足够量稀释好的Cyt-C一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；加荧光二抗；滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，封片。共聚焦显微镜观察并检测caspase-3和caspase-9的活性。

1.6 TUNEL检测

处理组：50 μl脱氧核苷酸末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)+450 μl荧光素标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)。对照组：50 μl 荧光素标记的dUTP。37℃孵育细胞30 min，50 μl TdT介导的dUTP 缺口末端标记测定法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)反应混合液加入标本中，暗湿盒中反应60 min。每组细胞随机选10个不同视野，荧光显微镜下计数凋亡细胞均值，重复3次。

1.7 免疫荧光检测

细胞爬片固定、通透、封闭后，分别加入CD31抗体(1∶500，Abcam)、Ⅷ因子(1∶1000，Abcam)和Cyt-C(1∶500，Abcam)孵育， 4℃过夜，加入驴抗兔二抗(1∶2000，Sigma)，孵育2 h。加细胞核染料4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)后孵育3 min，荧光显微镜观察。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 CMEC的培养、鉴定及Exe对CMEC的毒性作用

CMEC于培养瓶中贴壁生长24 h后逐渐铺展；72～96 h铺满瓶底，呈典型铺路石样结构。CD31和Ⅷ免疫细胞荧光染色检测结果显示，双阳性率>95%，证实为CMEC(图1)。MTT检测示，各组细胞细胞间活性差异无统计学意义(图2)。

2.2 Exe对H/R诱导的细胞凋亡的影响

与正常组相比，H/R模型组表现为TUNEL绿色荧光显著增强。予以Exe预处理 12 h，其以浓度依赖的方式降低TUNEL绿色荧光(P<0.05)[13]。荧光半定量实验结果表明，10 nmol/L为Exe的最佳抗凋亡浓度，因此作为后续干预的最佳处理条件(图3)。

图1 CMEC的免疫组织化学染色鉴定Figure 1 Identification of CMEC by immunohistochemistry (×400) CMEC: cardiac microvascular endothelial cells

图2 Exe对CMEC活性的影响Figure 2 Effect of Exe on cell viability (n=3) Exe: exenatide; CMEC: cardiac microvascular endothelial cells

2.3 Ca2+对H/R模型内XO表达量的影响

与H/R组和H/R+Iono组相比，H/R+Exe组和H/R+BAPTA组的XO表达量均显著降低，差异均具有统计学意义(P<0.05；图4)。

2.4 siRNA干扰技术对H/R模型内ROS的影响

与H/R组和H/R+siRNA对照组相比，H/R+Exe组和H/R+siRNA组的ROS荧光强度均显著降低，差异均具有统计学意义(P<0.05；图5)。

2.5 JC-1染色结果

与H/R组和H/R+siRNA对照组相比，H/R+Exe组、H/R+siRNA组和H/R+NAC组的线粒体膜电位均显著增加，而膜孔道开放程度均显著降低，差异均具有统计学意义(P<0.05；图6)。

2.6 Cyt-C释放

通过共聚焦显微镜观察Cyt-C的亚细胞定位发现，H/R损伤模型导致Cyt-C荧光在胞质内呈弥散状分布，并伴随caspase-3和caspase-9活性的显著上升，提示H/R模型使得线粒体凋亡通路激活。而与H/R组和H/R+siRNA对照组相比，H/R+Exe组、H/R+siRNA组和H/R+NAC组均可在一定程度上减少Cyt-C的释放，并伴随caspase-3和caspase-9活性显著降低，差异均具有统计学意义(P<0.05；图7)。

图3 Exe对H/R诱导的CMEC凋亡的影响Figure 3 Effect of Exe on apoptosis of CMEC induced by H/R A: results of staining (TUNEL ×200); B: quantitative analysis (n=5). Exe: exenatide; H/R: hypoxia/reoxygenation model; CMEC: cardiac microvascular endothelial cells. Compared with control group, *P<0.05; compared with H/R group, #P<0.05

图4 Ca2+对XO表达量的影响Figure 4 Influence of Ca2+ on expression of XO (n=3) A: western blotting; B: quantitative analysis. XO: xanthine oxidase; Exe: exenatide; H/R: hypoxia/reoxygenation model. Compared with control group, *P<0.05; compared with H/R group, #P<0.05; compared with H/R+Iono group, △P<0.05

图5 siRNA干扰技术对ROS荧光强度的影响Figure 5 Influence of siRNA on intensity of ROS (n=5)

ROS: reactive oxygen species; Exe: exenatide; H/R: hypoxia/reoxygenation model. Compared with control group,*P<0.05; compared with H/R group,#P<0.05; compared with H/R+siCtrl group,△P<0.05

3 讨 论

尽管PCI术能迅速开通堵塞血管、恢复冠状动脉血流灌注，但也增加了组织发生IRI的可能[14,20]。ROS爆发可导致组织细胞呈现氧化应激状态，是损伤细胞亚结构、诱导细胞进入程序性死亡的关键点[15]。

内皮细胞中ROS的来源较多，如线粒体呼吸链损伤、胞浆中的XO，以及蛋白底物代谢过程中产生的负离子电荷[16,17]。内皮细胞中线粒体的含量相对缺乏，在CMEC中，线粒体主要作为信号传导器发挥作用。已有研究证实[18]，在黄嘌呤脱氢酶大量转变为XO、以及XO自身转录增加的作用下，H/R环境中XO的表达量显著升高，其生成的ROS最终可诱导细胞凋亡的发生。

正常情况下，胞浆和线粒体内ROS的生成和清除处于动态平衡，但在病理情况下，CMEC胞浆的ROS生成过量，渗漏进入线粒体，导致线粒体呼吸链Ⅰ～Ⅳ型复合物的氧化，发生电子传递功能障碍，线粒体膜电位下降导致膜孔道开放，线粒体内膜与Cyt-C结合力下降，渗漏至胞浆，从而激活caspase-9/3线粒体凋亡蛋白家族[16]。已有研究证实[17]，H2O2诱导的干细胞氧化应激损伤模型可以激活线粒体经典凋亡通路、诱导干细胞凋亡，这一过程也是通过上述途径完成的。而予以Exe则可逆转这一损伤过程，显著降低干细胞凋亡。本研究证实，在CMEC的H/R损伤过程中，施加Exe预处理能够有效逆转XO-ROS诱导的线粒体损伤。

图6 JC-1染色结果及mPTP开放程度检测Figure 6 Results of JC-1 staining and mPTP tests A: results of staining (×200); B: quantitative analysis. Exe: exenatide; H/R: hypoxia/reoxygenation model; mPTP: mitochondrial permeability transition pore. Compared with control group, *P<0.05; compared with H/R group, #P<0.05; compared with H/R+siCtrl group, △P<0.05

图7 Cyt-C释放检测结果Figure7 Results of Cyt-C discharge A: results of staining (×400); B: quantitative analysis (n=5). Exe: exenatide; H/R: hypoxia/reoxygenation model. Compared with control group, *P<0.05; compared with H/R group, #P<0.05; compared with H/R+siCtrl group, △P<0.05

Exe为GLP-1受体激动剂，作用于胰岛细胞，降糖作用明显[18]。近年来的研究发现[19]，在循环血液中，Exe还可以与心脏上的GLP-1受体结合，进入细胞内，发挥抗凋亡作用，主要通过Camp/PKA信号转导途径，可显著改善线粒体功能。

综上所述，本研究证实了H/R损伤模型通过激活XO-ROS损伤信号，激活线粒体凋亡通路，引起CMEC结构和功能障碍。而予以Exe预处理可有效逆转此损伤信号通路，降低细胞的氧化应激损伤，提示Exe在I/R损伤过程中具有保护作用，不仅丰富了临床药物选择范围，也为应用Exe提供了可靠的理论基础。

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