卢文丽 宋秋佳 潘志强 方肇勤

上海中医药大学基础医学院 (上海, 201203)

原发性肝癌(PLC)是我国难治性恶性肿瘤之一，病死率高，肿瘤引发的侵袭、转移和术后复发是致死的主要原因[1]。在针对PLC的多种治疗方法中，基于辨证论治理论的中医药疗法，如健脾益气、行气活血、清热解毒等治则治法及方药，在预防和降低肝癌复发转移率等方面具有一定的优势[2～6]。我们前期研究发现：行气活血中药预知子(又名八月札)具有抑制肝癌细胞增殖作用，且影响到HepG2肝癌细胞众多基因，如整合素介导的细胞黏附通路基因表达。因此，我们拟进一步获得预知子籽乙醇提取物(ATKS)，设置不同的浓度和时间节点干预HepG2肝癌细胞，以观察对其增殖和形态的影响；同时筛选该通路上的高表达基因SEPP1及其上游基因CAPNS1、ITGA2、ITGAV、ITGB1和ITGB5，观察药物作用后mRNA表达变化，以及SEPP1蛋白表达变化。

1 材料与方法

1.1 细胞株 HepG2人肝癌细胞株购自中国科学院上海细胞所。细胞置于含10% 胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素的RPMI 1640 培养液中，在37℃、5% CO2充分湿度的培养箱中培养，3～4 d 传代一次，取对数生长期的细胞用于实验。

1.2 药物与试剂 预知子购自上海康桥中药饮片有限公司。RPMI 1640培养液、胎牛血清、青霉素-链霉素(100×)、0.25%胰酶-EDTA和Pierce BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自Thermo Fisher Scientific公司；四甲基偶氮哇蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均购自Sigma公司；Trizol购自Invitrogen 公司。鼠抗人SEPP1单克隆抗体购自Abcam公司，兔抗人GAPDH单克隆抗体购自上海碧云天生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂、BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)等均购自上海碧云天生物技术有限公司。PrimeScriptTMRT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq均购自Takara公司。

1.3 PCR引物设计及序列 引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成，引物序列见表1。

表1 SEPP1等基因引物序列(5’-3’)

1.4 主要仪器设备 R-220 SE旋转蒸发仪(瑞士BUCHI )；YJ-875G净化工作台(苏州净化设备厂)；Model 310 二氧化碳培养箱(ThermoFisher)；CKX41 荧光倒置相差显微镜(OLYMPUS)；ELX-800 全自动酶标仪(BioTek Synerge 2，BioTek Instruments)；7500 fast 实时荧光定量PCR 系统(Life Technologies)；WB小型垂直电泳槽(Bio-rad)、化学发光高灵敏度凝胶成像与分析系统FLuorChem E(Protein Simple)。

1.5 中药预知子乙醇提取物制备 乙醇回流法，从饮片中挑选出预知子的籽部分，60℃ 干燥过夜，粉碎；以10 倍量体积75%乙醇浸泡2h，80℃回流2 次，2h/次；合并回流液，过滤，浓缩，定容至0.5g /ml 浓度；滤过除菌，分装标记，-80℃保存备用。

1.6 MTT法检测细胞存活率 取对数生长期细胞接种入3 块96 孔板中，过夜后待细胞融合率在50%作用，以不同浓度的预知子籽药液(0.9mg/ml、1.2mg/ml、1.5mg/ml、1.8mg/ml、2.1mg/ml、2.4mg、2.7mg/ml、3.0 mg/ml)分别作用于细胞，另设空白组(无细胞及药物)和对照组(含细胞，无药物干预)，每组设8个复孔。24 h、48 h 和72 h 后，分别进行MTT 检测(72h检测前于显微镜下观察其细胞形态并快速拍照)，吸弃原培养液后加入200μl /孔0.5 mg /ml MTT 溶液，继续培养4 h后，吸弃MTT 溶液，加入150μl /孔DMSO 溶液，避光振摇10 min 后，在全自动酶标仪490 nm 波长处检测各孔的吸光度。计算细胞成活率(%) =(用药孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%。

1.7 分组及预知子提取物(ATKS)处理细胞 取对数生长期细胞接种入6 孔板中，过夜后待细胞融合率70～80%，以MTT检测72h 致细胞抑制率约为50%的药物浓度(即2.0mg/ml)作用于细胞，对照及中药组均各设4个复孔。72h后，采用1×PBS漂洗各孔1次，再收集细胞，其中2孔用于提取RNA进行RT-qPCR，另2孔用于提取蛋白进行Western Blot实验。

1.7.1 RTqPCR方法检测SEPP1 基因表达量 按Trizol 说明书抽提细胞总RNA，并按PrimeScript RTreagent Kit 和SYBR Premix Ex Taq说明书进行逆转录RT和实时荧光定量PCR，PCR反应程序均为95℃×1min→95℃×30S，60℃×30s(40个循环)。采用ΔΔCT法计算SEPP1基因mRNA相对表达量，以ACTB作为内参基因。结束后取PCR反应产物进行电泳。

1.7.2 Western Blot检测SEPP1 蛋白表达量 以RIPR裂解液[50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate，0.1% SDS]收获细胞，4℃条件下12000rpm离心15min，取上清液并测定蛋白浓度；蛋白上样量为20μg，SDS-PAGE胶浓度为8%，蛋白被转移至0.45 μm PVDF膜上，SEPP1一抗(1：2000)4℃条件下摇床孵育过夜，二抗(1:2000)室温孵育1h，BeyoECL 显色后采用成像与分析系统获得条带，以GAPDH作为内参。采用Image J图像软件进行灰度值计算。

2 结果

2.1 ATKS对HepG2肝癌细胞存活率的影响 ATKS对HepG2肝癌细胞增殖存在抑制作用，且呈时效和量效关系，随着时间延长，剂量加大，抑制作用越强。ATKS作用48h对HepG2肝癌细胞的半数抑制浓度约为2.3mg/ml；72h时间节点的半数抑制浓度约为2.0mg/ml，取该剂量用于后续实验，见图1。

图1 不同浓度和时间点ATKS对HepG2细胞的抑制作用

2.2 ATKS干预72h对HepG2肝癌细胞形态的影响 在0.9mg/ml、1.2mg/ml等较低浓度ATKS作用下，细胞形态和数量几乎没有什么变化；随着ATKS浓度的升高(1.5mg/ml～2.1 mg/ml)，HepG2细胞数量逐渐减少，细胞形态开始受到影响；ATKS 2.4 mg/ml以上时细胞数量锐减，状态变差，HepG2细胞所特有的重叠生长特征基本消失，药物细胞毒作用凸显，见插页图2。

2.3 ATKS对SEPP1等基因表达量的影响 2.0mg/ml ATKS作用72h后，与对照组比较，SEPP1基因mRNA表达量明显降低，其余5个基因却出现上调趋势，见表2和图3。

表2 ATKS作用72h后各基因表达量变化

与对照组比较，*P< 0.05

图3 ATKS作用72h后各基因表达量变化

2.4 ATKS对SEPP1蛋白表达量的影响 2.0mg/ml ATKS作用于HepG2细胞72h后，SEPP1蛋白表达量明显降低，其相对表达量(SEPP1/GAPDH)为0.642±0.070(P< 0.05)。与mRNA表达量变化趋势存在一致性。见图4，图5。

图4 ATKS作用72h后SEPP1蛋白表达量变化

图5 ATKS作用72h SEPP1蛋白条带

3讨论

我们早期针对肝癌临床辨证论治的流行病学调查研究[2-4]，以及相应中药复方用药规律的回顾性分析发现，各治法下所使用药物及频次有其客观规律[5，6]：行气活血药中，预知子(又名八月扎)、丹参、赤芍、桃仁、柴胡、郁金使用较多，其中预知子的用药频次接近43%，提示其在肝癌治疗用药中的重要性。但是，以往预知子在肿瘤抑制方面的机制研究较少，推测与预知子多以组分的形式出现在肿瘤治疗的复方中有关。仅有少量研究报导，预知子水提物、预知子籽醇提物、以及从预知子中提取的木通皂苷类成分具有抗肿瘤活性[13,15]。因此，预知子的药效及作用机制存在较大的研究空间，涉及单味药、联合用药以及有效成分等多个方面。

因此，我们采用健脾益气、行气活血、清热解毒等治法代表性复方制剂，进行体外实验，观察其对肝癌细胞恶性增殖作用的影响，发现行气活血复方对肝癌细胞恶性增殖具有一定的抑制作用，且随着剂量的加大，其抑制肝癌细胞增殖的作用显著增强[7]。我们进一步在行气活血复方中筛选可能起着主要作用的药物，发现预知子的抑制作用值得关注[8]。之后，进一步分拆预知子的不同部位，发现预知子籽的药效最为显著[9，10]。预知子籽的正丁醇萃取物影响到HepG2细胞众多通路基因表达，其中整合素介导的细胞黏附通路(KEGG PATHWAY Database)值得关注，而前期芯片结果显示，药物未作用前，SEPP1及其上游的CAPNS1、ITGA2、ITGAV、ITGB1和ITGB5等6个基因是该通路中最高及较高的差异表达基因[11]。SEPP1基因与多种肿瘤相关，涉及细胞黏附、转移、增殖等[12～16]。在涉及肿瘤组织SEPP1的表达及调控机制时，多围绕抗氧化应激展开，但许多内在机制仍未被阐明。

在此背景下，我们进一步设置了不同的浓度和时间节点，观察到预知子籽的乙醇提取物(ATKS)确实能有效抑制HepG2肝癌细胞增殖，并具有量效和时效关系；ATKS处理后SEPP1基因表达明显下调，CAPNS1、ITGA2、ITGAV、和ITGB1等基因表达上调，与前期芯片结果一致；但是ITGB5的上调趋势与前期芯片结果相反，可能是由于预知子籽的正丁醇萃取物和乙醇萃取物中有效成分差异所致。此外，鉴于SEPP1是该通路中的最高表达基因，且与其他基因存在不同的变化趋势，我们进一步观察了其在蛋白层面上的变化，发现与其mRNA水平的变化存在一致性的下调。总体上认为，以上基因或蛋白层面上的变化，体现了ATKS对HepG2细胞增殖抑制作用的部分机制。

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