曾维伟,何镇宏,陆兆新,吕凤霞,别小妹,赵海珍,张 充

(南京农业大学,江苏南京 210095)

植物乳杆菌163产抗菌物质的发酵条件优化

曾维伟,何镇宏,陆兆新*,吕凤霞,别小妹,赵海珍,张 充

(南京农业大学,江苏南京 210095)

本文优化了从泡菜中发现的一株植物乳杆菌163产植物乳杆菌素的发酵条件,并通过单因素实验、Plackett-Btmnan实验、Box-Behnken 实验的响应面方法得到的最佳的发酵培养基为:麦芽糖浆55 g/L,玉米浆干粉20 g/L,乙酸钠8 g/L,柠檬酸氢二铵6 g/L,吐温-80 1.26 g/L,发酵条件:初始pH4.7,接种量为2%。最终抑菌圈直径提高到了31.90 mm,比原来的MRS培养基发酵提升了1.10倍。本次优化不仅提升了发酵液的抑菌活性,并且获得了一种成本低廉的可以大规模应用的食品级培养基配方。

植物乳杆菌163,响应面方法,植物乳杆菌素

植物乳杆菌163是由本实验室在贵州泡菜中筛选出的一株具有广谱抑菌活性的乳酸菌,其所产的植物乳杆菌素163和163-1具有抑菌谱广、热稳定性好和酸碱稳定性好的特点[1]。植物乳杆菌素163和163-1是乳酸菌产生的细菌素,是两种活性多肽。目前已发现并正被广泛研究的细菌素有乳酸链球菌素(Nisin)、乳球菌素(Lactococcin)、片球菌素(Pediocin)、明串珠菌素(Canonic)等几十种[2]。但只有少数被证明在食品和生物医学领域有重要的经济潜能,如AMPs、Nisin等,被用作食物防腐剂[3]。其中Nisin己通过FAO/WHO认证,并被世界几十个国家和地区广泛用于食品防腐保鲜。Nisin是由34个氨基酸组成的活性多肽,而植物乳杆菌素163和163-1是由氨基酸组成的活性多肽结构,且它们都具有广谱抑菌活性的特点,因此能够发酵产生两种细菌素的植物乳杆菌163有较大的研究和应用潜力。

但是植物乳杆菌产细菌素的能力制约着其的生产和应用,细菌素的产量不仅和乳酸菌菌株自身的特性有关,而且还受到发酵条件的制约。如培养基成分、发酵pH、接种量等因素的影响[4]。因为多因素的共同影响使得优化变得相当复杂,因而科学有效的方法就显得尤为重要,响应面方法(response surface methodology,RSM)通过实验设计、建模、因子效应评估,最后获得一个最佳解决途径,随着计算方法的普及和发展,开始应用于生物技术的许多方面[5]。响应面法则是在通过Plackett-Burman 实验筛选出显著因子的基础上,对几个显著的因子建立连续变量曲面模型,并对他们的交互作用进行评价,最终快速有效地得到优化后的条件[6]。

表1 盐离子正促进因素筛选实验设计

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种 植物乳杆菌163Lactobacillusplantarum163来源于实验室分离菌株，现由中国微生物保藏中心保藏(No.8224);指示菌 藤黄微球菌(CMCC 28001);MRS基础培养基[7]葡萄糖2%,牛肉膏l%,蛋白胨1%,酵母浸粉0.5%,柠檬酸氢二铵0.2%,磷酸酸氢二钾0.2%,醋酸钠0.5%,硫酸镁0.058%,吐温-80 0.1%,硫酸锰0.025%,pH6.2～6.4,蒸馏水1 L，灭菌条件:115 ℃,30 min;种子液培养基 MRS培养基(同上);营养肉汤琼脂培养基(NA) 牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,氯化钠0.5%,pH7.2～7.4,蒸馏水1 L。

DK-8D数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;SW-CJ-1FD超净工作台 苏净集团安泰公司;DRP-9612隔水式电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂;ORION 3-star pH计 美国Thermo公司;5804 R台式离心机 美国Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法 从甘油管中将冻存的植物乳杆菌接种到装有50 mL MRS培养基液体的100 mL三角瓶中,于37 ℃培养箱静置培养24 h后作为种子液。以2%的接种量接入发酵培养基中,静置发酵48 h。发酵液以8000 r/min离心10 min后,取上清待用[1]。

1.2.2 指示菌悬液的制备 将检指示菌藤黄微球菌接至斜面,37 ℃培养24 h,再接入100 mL种子培养基(NA),33 ℃,180 r/min,培养8～12 h,至菌对数生长中后期,取出置于冰箱备用,作为指示菌种子液。

1.2.3 抑菌效价测定方法 利用牛津杯单层琼脂法[8]:在18 cm平板上放入牛津杯后倒入混有浓度为106～107cfu/mL的指示菌的培养基,待培养基凝固后取出牛津杯,在各孔中加入200 μL发酵上清,在37 ℃培养12 h,测定抑菌圈直径。根据植物乳杆菌163发酵上清液的抑菌圈大小表示抑菌效价[9]。

1.2.4 Nisin标准液的配制 准确称取0.8 g Nisin(1000 U/mg),溶于100 mL 0.02 mol/L HCl中,配制成8000 U/mL Nisin 标准液备用。需要时用0.02 mol/L HCl稀释成250、500、1000、2000、4000和8000 U/mL几种浓度的溶液。

1.2.5 培养基单因素实验 单因素实验如下进行[10]:

碳源单因素实验:以MRS培养基为基础,发酵培养基中分别以2%的糖蜜、乳糖、可溶性淀粉、麦芽糖浆、脱脂奶粉作为碳源,以MRS液体培养基作为对照,以单层琼脂牛津杯法确定植物乳杆菌163对藤黄微球菌的抑菌效果,确定最优碳源,并对该碳源的浓度进行确定。

氮源单因素实验:以MRS培养基为基础,100 mL培养基中分别以2%的酵母提取物、鱼粉蛋白胨、黄豆粉、玉米粉、酵母膏、玉米浆干粉、牛肉膏、大豆蛋白胨作为氮源,以MRS液体培养基作为对照,以单层琼脂牛津杯法确定植物乳杆菌163发酵上清对藤黄微球菌的抑菌效果,确定最优氮源,并对该氮源的浓度进行确定。

盐离子单因素实验:以MRS培养基为基础,以乙酸钠、柠檬酸铵、柠檬酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、乙酸铵、乳酸钠为盐因素进行正促进因子筛选[11],对促进作用最大的几种盐离子确定其使用浓度。

刺激因子单因素实验:以MRS培养基为基础,培养基中分别添加1%、2%、3%、4%、5%的吐温作为刺激因子,以MRS液体培养基作为对照,以单层琼脂牛津杯法确定植物乳杆菌163发酵上清对藤黄微球菌的抑菌效果,确定最优刺激因子浓度。

1.2.6 发酵条件单因素实验优化 接种量单因素实验:以优化后的培养基为基础,以原pH,分别以接种量1%、2%、3%、4%接种优化后培养基,37 ℃培养48 h后,以牛津杯抑菌圈的大小确定接种量对藤黄微球菌抑菌活性的影响。

初始pH优化:以优化后的培养基为基础培养基,在初始pH分别为5.4、5.7、6.0、6.3、6.6条件下,按2%的接种量37 ℃培养48 h后,以牛津杯抑菌圈的大小确定初始pH对藤黄微球菌抑菌活性的影响。

1.2.7 PB实验(Plackett and Burman Design) 为了从上述单因素实验中挑选主要实验结果影响的因素[12],我们进行了PB实验。实验设计如表2。

表2 PB实验设计

1.2.8 响应面设计(Box-behnken(BBD)) 通过单因素实验,确定响应面实验设计的因素和水平,通过PB实验选取3个主要影响因子的水平为自变量,同时通过爬坡实验如表3趋近响应面设计的中心点[13]。采用三因素三水平的响应面分析方法设计实验,因素和水平设计选择如下表4。

表3 爬坡实验设计

表4 响应面设计

1.2.9 验证实验 将响应面设计得到培养基组成和优化的发酵条件进行实验验证,将实际值和预测值进行比较[14]。

1.2.10 数据处理 所有实验均重复3次,使用SPSS 19.0和Excel进行数据处理。实验设计通过Design Expert 8.06b进行。

2 结果与分析

2.1 Nisin标准曲线

利用通过Nisin标准曲线法来测定发酵优化后的发酵液抑菌效价,通过不同浓度的Nisin的抑菌圈的测定,我们获得了抑菌活性与抑菌圈直径之间的关系,如下图1所示,二者的方程为y=0.1913x+0.0267,R2=0.9979,测定方法可行。

图1 Nisin标准曲线Fig.1 The standard curve of Nisin

2.2 培养基单因素实验

2.2.1 碳源单因素实验 从图2中可以看出,原MRS培养基使用的葡萄糖效果最好,乳糖和麦芽糖浆次之,脱脂奶粉效果较差,可溶性淀粉和糖蜜没有效果,可能与葡萄糖参与某一代谢途径有关,但综合效果和成本的两方面考虑,使用麦芽糖浆最为合适。

图2 碳源种类对抑菌活性的影响Fig.2 Effects of different carbon sources on antimicrobial activity

同时,对麦芽糖浆浓度的研究结果见图3,从图3中可以看出,麦芽糖浆浓度在4%时抑菌圈直径达到最大,麦芽糖浆浓度继续增加,抑菌圈直径呈现一定的下降趋势,因此选择4%作为麦芽糖浆的使用浓度。

图3 碳源浓度对抑菌活性的影响Fig.3 Effect of carbon source concentration on antimicrobial activity

2.2.2 氮源单因素实验 由图4可以看出,抑菌效果比较好的氮源有玉米浆、酵母提取物(YE)、酵母膏、大豆蛋白胨、麦芽浸粉这五种物质,综合考虑成本因素,选用玉米浆干粉作为最终使用的氮源,并且使得之前MRS培养基中复合氮源简化为单一氮源,使得培养基更加简单化。

图4 氮源种类对抑菌活性的影响Fig.4 Effects of different nitrogen sources on antimicrobial activity

选择玉米浆干粉作为唯一氮源后,我们对其使用浓度进行了确定,从图5中可以看出,玉米浆干粉的使用效果在4%之前呈上升趋势,4%后呈下降趋势。经显著性分析发现1%与2%效果相差不显著,2%和4%的效果相差不显著,但由于1%与4%差异显著,因此最终选择2%的玉米浆干粉作为优化后的氮源。

图5 氮源浓度对抑菌活性的影响Fig.5 Effect of nitrogen source concentration on antimicrobial activity

2.2.3 盐离子单因素实验 对上述七种盐离子进行正促进因子筛选实验后,发现对实验结果正促进作用最大的两种盐离子分别是乙酸钠和柠檬酸氢二铵。如图6所示,乙酸钠的最佳使用浓度在8%左右。如图7所示,柠檬酸氢二铵的最佳使用浓度在6%左右。

图6 乙酸钠浓度对抑菌活性的影响Fig.6 Effect of CH3COONa concentration on antimicrobial activity

图7 柠檬酸氢二铵浓度对抑菌活性的影响Fig.7 Effect of diammonium citrate concentration on antimicrobial activity

2.2.4 刺激因子单因素实验 如下图8所示,随着刺激因子吐温-80的使用浓度使用的增加,抑菌活性呈下降趋势。这可能与刺激因子吐温-80会增加细菌细胞膜的通透性有关,高浓度的吐温-80可能对细菌生长产生影响。因此吐温-80的最佳浓度是1%。

图8 刺激因子的浓度对抑菌活性的影响Fig.8 Effect of stimulating factor concentration on antimicrobial activity

2.3 发酵条件单因素实验

2.3.1 接种量的单因素实验 从图9可以看出,抑菌活性在接种量为2%时最大,因而最终选择2%为接种浓度。

图9 接种量对抑菌活性的影响Fig.9 Effect of inoculation amount on antibacterial activity

2.3.2 初始pH的单因素实验 从图10可以看出,初始pH在5.7时使得发酵液上清的抑菌圈直径最大,因此选择pH5.7作为发酵的起始pH。

2.4 Plackett-Btmnan实验

表6 PB实验方差分析结果

图10 初始pH对抑菌活性的影响Fig.10 Effect of initial pH value on antibacterial activity

注:*表示显著p<0.05,**表示极显著,p<0.01。

通过上述PB实验设计评价单因素获得的七个因子A:麦芽糖浆、B:玉米浆干粉、C:乙酸钠、D:柠檬酸氢二铵、E:吐温-80、F:初始pH、G:接种量,实验结果见表5。通过方差分析(表6)发现A:麦芽糖浆、E:吐温-80、F:初始pH三个因子对实验结果影响显著性排在前三,后续均以原单因素实验的最优值作为发酵条件,因此我们选择麦芽糖浆、吐温-80和初始pH来进行后续的爬坡实验。

表5 PB实验结果

2.5 爬坡实验

为了使最终得到的响应面的曲面曲度达到要求,也就是让实验点更接近于实验的中心点[15],进行了如表3的爬坡实验,对五组设计进行实验后发现,抑菌圈直径的最大值为4号实验,因此最终选择4号实验组作为响应面设计的中心点,即麦芽糖浆55 g/L、吐温80 1.6 g/L、初始pH为4.8。

2.6 响应面实验及模型的建立

响应面实验设计和结果见表7,并对响应面实验进行方差分析结果见表8。通过Design Expert软件进行计算和分析,得到的抑菌圈直径R1和三个因素A:麦芽糖浆(g/L),B:吐温-80(g/L),C:初始pH的拟合方程为:

R1=31.96-0.055A-0.33B+0.010C+0.035AB-0.64AC+0.46BC-1.26A2-0.54B2-0.85C2

式(1)

表7 最陡爬坡实验结果

表8 响应面实验及结果

表9 响应面方差分析结果

注:*表示显著p<0.05,**表示极显著,p<0.01。

上述分析结果表明:模型的p=0.0242<0.05,说明整个模型显著,所拟合的二次回归方程适合。失拟误差p=0.0579>0.05,失拟相对误差不显著,因此,可用此模型对植物乳杆菌163发酵产细菌素的条件进行预测和分析。利用Design Expert软件拟合出来的响应面及等高线见图11,从图中可见三个抛物面开口向下,均出现了最高点。通过软件分析计算得到当A=54.83 g/L,B=1.26 g/L,C=4.73时,响应面有最大值32.01。因此取麦芽糖浆55 g/L,吐温-80 1.26 g/L,初始pH4.7,玉米浆干粉20 g/L,乙酸钠8 g/L,柠檬酸氢二铵6 g/L,接种量为2%为优化的最优培养基,预测得到的抑菌圈直径可达到32.01 mm,并以此培养基和发酵条件进行验证实验。

图11 因素交互的响应面图Fig.11 Response surface plots of variable parameters

2.7 验证实验

为了验证模型拟合出来的预测值,利用已优化的培养条件和原有条件均进行3次重复发酵实验,实验得到原有条件的抑菌圈直径为29.11 mm,优化条件后得到的抑菌圈直径为31.90 mm,与预测值的拟合率达到99.65%,说明预测值与实际值相差不大,模型拟合较好[16]。

3 结论

通过单因素实验、Plackett-Btmnan实验、最陡爬坡实验、响应面实验得到的最终得发酵培养基为:麦芽糖浆55 g/L,玉米浆干粉20 g/L,乙酸钠8 g/L,柠檬酸氢二铵6 g/L,吐温-80 1.26 g/L,发酵条件:初始pH4.7,接种量为2%。食品级培养基的筛选除了要考虑安全,也需要考虑生产的实际成本,本次优化将原MRS发酵的植物乳杆菌163抑菌圈直径从29.11 mm提升到了31.90 mm。本次优化的培养基配方将原来MRS培养基的10种成分减为5种成分,且成分均为食品级原料。同时优化后的培养基中的麦芽糖浆、玉米浆干粉等成本比原有的葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏等的成本低,性价比更高,为后续植物乳杆菌的大规模发酵和应用提供了很好的基础。

[1]Hu M,Zhao H,Zhang C,et al. Purification and Characterization of Plantaricin 163,a Novel Bacteriocin Producedby Lactobacillus plantarum 163 Isolated from Traditional Chinese Fermented Vegetables[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,2013,61(47):11676-11682.

[2]裴家伟,吴荣荣,马静,等. 乳酸菌产生的拮抗物质:一类延长食品货架期的生物防腐剂[J]. 中国乳品工业,2003(6):17-21.

[3]Antonio G,Hikmate A,Rosario L L,et al.Bacteriocins-based strategies for food biopreservation[J].Internationnal Journal of Food Microbiology,2007,120(1-2):51-70.

[4]孟庆龙. 乳酸菌素Lacticin 518发酵条件的优化[D]. 合肥:安徽农业大学,2009.

[5]张艳,李永哲. 响应面法及其在药学领域中的应用[J]. 吉林化工学院学报,2012,29(7):20-26.

[6]王涛,颜明,郭海波. 一种新的回归分析方法——响应曲面法在数值模拟研究中的应用[J]. 岩性油气藏,2011,23(2):100-104.

[7]陆兆新,胡美忠,吕凤霞,等. 一种植物乳杆菌、其细菌素以及培养与分离纯化方法:CN10470098[P]. 2013.

[8]刘冬梅,李理,杨晓泉,等. 用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力[J]. 食品研究与开发,2006,27(3):110-111.

[9]党丽娟,高钰淇,别小妹,等.60Coγ射线复合硫酸二乙酯诱变选育高产新型细菌素Plantaricin163-1菌株的研究[J]. 食品工业科技,2015,36(15):174-179.

[10]王小明,石晓艳,吴巨贤,等. 发酵型菠萝酸奶生产工艺[J]. 食品研究与开发,2011,32(2):72-76.

[11]梁昭磊,何桢. 基于数据挖掘的实验设计中因素筛选方法研究[J]. 组合机床与自动化加工技术,2008(5):88-91.

[12]Chen H,Hui Y,Wu Y,et al. Application of plackett-burman design in screening of carbohydrate,prebiotics/alcohols and protein/amino acid for cryoprotectants of Streptococcus thermophilus[J]. Advance Journal of Food Science & Technology,2015,7(5):314-319.

[13]Ma L,Wang L,Tang J,et al. Optimization of arsenic extraction in rice samples by Plackett-Burman design and response surface methodology.[J]. Food Chemistry,2016,204:283-288.

[14]张佳鑫,刘龙,李江华,等. 利用响应面法优化Aspergillus sp.BCRC 31742产氨基葡萄糖发酵培养基[J]. 工业微生物,2013,43(2):51-57.

[15]胡丽娟,薛高尚,卢向阳,等. 响应面法优化芽孢杆菌25-2产纤维素酶发酵条件[J]. 酿酒科技,2012(4):21-26.

[16]马怡璇,毛凯,莫婷,等. 响应面实验优化葡萄糖酸钠铁合成工艺及其理化性质分析[J]. 食品科学,2016,37(6):64-70.

Optimization of fermentation conditions of the production of antibacterial substances byLactobacillusplantarum163

ZENG Wei-wei,HE Zhen-hong,LU Zhao-xin*,LV Feng-xia,BIE Xiao-mei,ZHAO Hai-zhen,ZHANG Chong

(Nanjing Agriculture University,Nanjing 210095,China)

Optimization of fermentation conditions of the production of plantaricin byLactobacillusplantarum163,which was isolated from Chinese traditional pickled cabbage in our laboratory,was carried out using single-factor experiments,a Plackett Burman design(PB),a Box-Behnken design(BBD)and response surface methodology(RSM). The best concentration of the optimized medium was 55 g/L maltose syrup,20 g/L corn steep powder,8 g/L CH3COONa,6 g/L diammonium citrate,1.26 g/L Tween-80,and initial pH value 4.7,inoculum 2%.The inhibitory diameter has increased to 31.90 mm,which is 1.10 times lager than cultured in MRS medium.The optimization had not only improved the antimicrobial activity of the fermentation broth,but also found a food grade and cheap medium which could be used in large scale.

Lactobacillusplantarum163;response surface methodology;plantaricin

2016-09-01

曾维伟(1993-)，男，硕士研究生，研究方向：食品生物科技，E-mail:2015108041@njau.edu.cn。

*通讯作者:陆兆新(1957-)，男，教授，研究方向: 酶工程、食品微生物、农产品加工，E-mail:fmb@njau.edu.cn。

国家科技支撑计划(2015BAD16B04)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)06-0147-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.020