刘 露，王梓廷，刘 杨，韩 娟，廖允成，温晓霞

(西北农林科技大学 农学院，陕西杨凌 712100)

长期施用生物炭对土娄土土壤理化性质及微生物的影响

刘 露，王梓廷，刘 杨，韩 娟，廖允成，温晓霞

(西北农林科技大学 农学院，陕西杨凌 712100)

为了研究生物炭对土壤改良的影响是否具有长期效应，对施用不同量生物炭0 kg/hm2(CK),1 000 kg/hm2(T1),5 000 kg/hm2(T2),10 000 kg/hm2(T3) 4 a之后的土娄土进行氮素和碳素质量分数测定和土壤氨氧化菌、反硝化细菌的定量分析。结果表明：与未添加生物炭的土壤(CK)相比，在冬前分蘖期和拔节期T2和T3处理下的氨氧化菌丰度显著高于CK;在冬前分蘖期、拔节期和成熟期生物炭处理下的反硝化细菌丰度显著高于CK。土壤铵态氮质量分数在分蘖前期、拔节期和成熟期的T3处理下显著高于CK；土壤硝态氮质量分数在拔节期和成熟期的T2和T3处理下分别显著高于CK；土壤碱解氮质量分数在越冬期和拔节期分别是CK和T3达到最高水平，且显著高于其他处理；土壤全氮质量分数在分蘖前期和开花期的T3和T1处理下达到最高水平，均显著高于CK；土壤有机碳质量分数在拔节期、开花期和成熟期的T3处理下达到最高水平，且显著高于CK，但CK和T1、T2之间无显著差异。可见，施用生物炭1 000 kg/hm2(T1)和5 000 kg/hm2(T2)4 a之后，与CK相比土壤氮素和碳素的提高不明显；生物炭处理与CK相比，添加生物炭提高土壤中反硝化细菌丰度；施用生物炭10 000 kg/hm2(T3)显著提高土壤中氨氧化菌丰度。

生物炭；氮素；碳素；氨氧化菌；反硝化细菌

陕西关中平原是中国冬小麦的主要产区，其产量高低对陕西省的粮食安全影响显著。为了保持高产，该地区在小麦生产中普遍使用高肥高水的措施，虽然在一定程度上显著提高小麦产量，但大量的化肥施用会显著降低氮肥利用效率，同时不合理的施肥会造成小麦群体质量恶化、倒伏严重、产量及品质下降等不良影响，更会造成严重的生态危害[1-2]。生物炭是生物质材料在高温无氧的环境中经过热解形成富含有机碳[3]的一种稳定的土壤改良剂[4]，生物炭的表面有很多小孔，这样的结构决定生物炭对土壤铵离子较强的吸附作用[5]；并且能显著提高土壤全氮及有机碳质量分数进而提高土壤肥力[6]。还有研究发现，生物炭可以增加土壤通气性，通过提高土壤中氧的质量分数，从而降低土壤中的硝化反应，同时促进土壤氮质量分数的提高[7]。但目前关于生物炭的研究多集中于添加生物炭对土壤水分、养分质量分数及作物生长发育的影响[8-10]，而关于生物炭施用对土壤微生物活性的影响研究报道较少。本试验以关中冬小麦麦田土壤为对象，研究施入生物炭4 a之后，对土壤氮素和碳素及微生物的影响，为生物炭在关中地区农业生产的长期应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验设在陕西省咸阳市杨凌区西北农林科技大学标本园试验地(108°24′E，34°20′N，海拔521 m)，该区属于渭北旱塬，暖温带季风气候，年均降雨量500～700 mm，年均日照时数2 196 h，无霜期210 d。试验区土壤属土娄土，其中粘粒、粉粒和沙砾质量分数分别为6.5%、61.1%、2.4%，耕层( 0～20 cm) 土壤有机质14.11 g/kg,速效磷7.73 mg/kg,速效钾152.03 mg/kg,pH 7.61(水土质量比为1∶1)。采用的生物炭来自河南三利新能源公司，其基本理化性质为有机碳467.05 g/kg,全磷0.61 g/kg,全氮5.90 g/kg,钾26.03 g/kg,C/N为79.10，灰分质量分数20.8%，pH 10.40。

本研究是长期定位试验，2011年将生物炭一次施入土壤中，之后不再补施。设4个处理，施用水平分别为：0 kg/hm2(对照CK)、1 000 kg/hm2(T1)、5 000 kg/hm2(T2)、10 000 kg/hm2(T3)。采用随机区组设计，每处理3次重复，小区面积5 m×4 m=20 m2，小麦品种采用‘陕麦139’，于2015-10-05播种，于2016-06-04收获。

1.2 测定项目与方法

分别在冬小麦分蘖前期、越冬期、拔节期、开花期和成熟期，取0～20 cm的耕层土壤，先过2 mm筛除去土壤中的杂质，分装成2份，一份土样迅速带回实验室置于-40 ℃保存，用于土壤硝铵态氮的测定与土壤微生物DNA的提取；另一份土样风干过筛后用于测定土壤中全氮、碱解氮及有机质质量分数测定。

1.2.1 土壤理化指标测定 采用流动注射分析仪进行测定土壤硝铵态氮，土壤全氮质量分数采用凯氏定氮仪测定，土壤碱解氮质量分数测定采用碱解扩散法，采用重铬酸钾外加热法进行土壤有机碳的测定。

1.2.2 氨氧化细菌和反硝化细菌的实时荧光定量 称取新鲜土壤0.5 g，采用MP试剂盒提取土壤微生物DNA。氨氧化菌的引物为amoA-1F和amoA-2R，实时荧光定量PCR扩增反应体系为：10 μL的SYBR，上下游引物(20 pmol/μL)各0.4 μL、0.5 μL的土壤微生物DNA模板，7.9 μL的灭菌双蒸水和0.8 μL的BSA，反应体系总体积为20 μL；反硝化细菌的引物为cd3F和R3cd，实时荧光定量PCR扩增反应体系为：10 μL的SYBR，上下游引物(20 pmol/μL)各0.5 μL，1 μL的土壤微生物DNA模板和8 μL的灭菌双蒸水。定量PCR反应在CFX96TMReal-Time System(Bio-Rad公司)扩增仪上进行。通过定量PCR扩增得到的基因拷贝数用于后续计算。

1.3 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2007和SigmaPlot 12.5分别进行数据整理和作图，采用SPSS 16.0对数据进行方差分析及相关性分析。

2 结果与分析

2.1 生物炭对土壤氨氧化细菌和反硝化细菌的影响

如图1所示，氨氧化细菌在冬前分蘖期，在T2处理下的拷贝数对数达到最大4.75，T1处理下氨氧化菌质量分数最低，且4个处理之间差异显著；在越冬期CK显著高于生物炭处理；在拔节期T2和T3处理下的氨氧化细菌数量分别显著高于CK和T1 9.94%、8.85%和10.57%、9.48%；在开花期T3处理下的氨氧化细菌数量显著高于T1、T2和CK；在成熟期氨氧化菌在4个处理下无明显差异。

图1 不同生物炭施用量下土壤的氨氧化菌拷贝数的常用对数Fig.1 Common logarithm of soil amoA gene copy number under different biochar amount

如图2 所示，反硝化细菌数量在小麦整个生育期中呈现出逐渐上升的趋势；在分蘖前期，反硝化细菌数量在T1和T3处理下显著高于CK；在拔节期，T2处理下的反硝化细菌数量最高，CK最低，T1和T2显著高于CK；在成熟期，反硝化细菌在T2处理下数量最高，CK最低，生物炭处理下反硝化细菌数量显著高于CK；而在越冬期和开花期，4种处理下反硝化菌数量之间无显著差异。

2.2 生物炭对土壤硝态氮和铵态氮质量分数的影响

由图3可知，分蘖前期4个处理下土壤中的硝态氮质量分数表现为T3最高，且显著高于CK、T1和T2各处理45.6%、26.2%和47.9%。在拔节期，T3和T2处理下的硝态氮质量分数显著高于CK和T1的48.75%、53.72%和31.39%、35.78%；CK和T1处理下的硝态氮质量分数最低，之间无显著差异。在成熟期，生物炭处理下的硝态氮质量分数均显著高于CK，T1、T2和T3分别显著高于CK 69.54%、40.07%和142.05%。在越冬期和开花期，各处理下的硝态氮质量分数无显著差异。

图2 不同生物炭施用量下反硝化细菌拷贝数的常用对数Fig.2 Common logarithm of soil nirS gene copy number under different biochar amount

图3 不同生物炭施用量下土壤硝态氮的质量分数Fig.3 Soil nitrate nitrogen mass fraction under different biochar amount

在小麦整个生育期，各处理下的土壤铵态氮质量分数呈现出逐渐降低的趋势。在分蘖前期和越冬期，各处理下的铵态氮质量分数表现为T1和T3均显著高于CK和T2。在拔节期，各处理下的铵态氮质量分数表现出T2和T3显著高出CK和T1的37.16%、24.88%和69.67%、54.57%。在开花期，各处理下的土壤铵态氮质量分数表现为T2和T3处理分别显著高于CK和T1。在成熟期，各处理下的土壤铵态氮质量分数之间无显著差异(图4)。

2.3 生物炭对土壤碱解氮质量分数的影响

由图5可知，在小麦各个生育时期，土壤碱解氮质量分数整体表现为先降低后增加的趋势。在分蘖前期，T1显著高于T3，而CK和T2与各处理之间的差异并不显著。在越冬期，土壤碱解氮质量分数表现为CK质量分数最高，且显著高出T1、T2和T3的21.34%、40.21%和21.64%。在拔节期，土壤碱解氮质量分数表现为T3处理显著高于CK、T1和T2，而CK、T1和T2处理的碱解氮质量分数之间无显著差异。在开花期，T1显著高出CK的13.16%，而T2和T3与其他处理之间无显著差异。在成熟期，土壤碱解氮质量分数表现为CK、T2和T3均显著高于T1。

图4 不同生物炭施用量下土壤铵态氮的质量分数Fig.4 Soil ammonium nitrogen mass fraction under different biochar amount

图5 不同生物炭施用量下土壤碱解氮的质量分数Fig.5 Soil available nitrogen mass fraction under different biochar amount

2.4 生物炭对土壤全氮质量分数的影响

土壤全氮质量分数在小麦整个生育期表现出和碱解氮相似的变化趋势均先降低后增加。由图6可知，在分蘖前期，T3处理显著高出T1 33.21%，而CK和T2与其他各处理之间无显著差异。在拔节期，各处理下的土壤全氮质量分数表现为T2和T3显著高于CK和T1，且分别高出CK和T1 42.31%、55.58%和18.03%、29.04%。在开花期，各处理下的土壤全氮质量分数表现为T1显著高于CK、T2和T3。在越冬期和成熟期，各处理下的土壤全氮质量分数间无显著差异。

2.5 生物炭对土壤有机碳质量分数的影响

由图7可知，土壤有机碳质量分数除T3外均表现出先降低后升高的状态。在分蘖前期，CK与T2处理均显著高于T1和T3。在越冬期，各处理下的土壤有机碳质量分数间无显著差异。在拔节期T3处理下的土壤有机碳质量分数最高，显著高出CK、T1和T2 38.03%、60.71%和50.83%。在开花期和成熟期，T3处理下的土壤有机碳质量分数显著高于CK、T1和T2。

图6 不同生物炭施用量下土壤全氮的质量分数Fig.6 Soil total nitrogen mass fraction under different biochar amount

2.6 相关分析

表1表明，未添加生物炭处理下的氨氧化菌与土壤中的氮素及有机碳间无显著相关性，而反硝化细菌与铵态氮和有机碳质量分数均呈极显著负相关。而在添加生物炭的土壤中，有机碳质量分数对氨氧化细菌呈显著正相关，而反硝化细菌则与土壤中的全氮、铵态氮质量分数呈极显著负相关，与有机碳的质量分数呈显著负相关；与硝态氮、碱解氮质量分数显著无相关性。

图7 不同生物炭施用量下土壤有机碳的质量分数Fig.7 Soil organic carbonmass fraction under different biochar amount

表1 氨氧化细菌和反硝化细菌拷贝数的常用对数与土壤氮素之间的皮尔逊相关性分析
Table 1 Pearson correlation analysis between common logarithm of amoA and nirS gene copy number and soil physical and chemical properties

项目Item全氮Totalnitrogen硝态氮Nitratenitrogen铵态氮Ammoniumnitrogen碱解氮Availablenitrogen有机碳Organiccarbon未添加生物炭 Withoutbiochar 氨氧化菌 amoAgene0．4030．377-0．1440．4330．266 反硝化细菌 nirSgene-0．0280．121-0．836∗∗-0．47-0．791∗∗添加生物炭 Withbiochar 氨氧化菌 amoAgene0．1350．058-0．1750．0770．393∗ 反硝化细菌 nirSgene-0．33∗∗-0．204-0．626∗∗0．074-0．377∗

注：“*”和“**”分别表示在0.05和0.01水平的相关性。

Note:“*” and “**” mean correlation at 0.05 and 0.01 level,respectively.

3 讨 论

3.1 生物炭对土壤氮素和有机碳质量分数的影响

生物炭处理 4 a之后与对照相比并没有显著提高碱解氮和全氮质量分数，这与Jones等[11-12]的研究结果相一致；生物炭施用量为1 t/hm2、5 t/hm2对第4年的麦田土壤硝铵态氮质量分数提高的影响并不显著，只有施用量达到10 t/hm2时才能显著提高小麦土壤中的硝铵态氮质量分数，而何飞飞等[13]的研究表明添加少量的生物炭就可以提高酸性土壤中硝态氮的质量分数，这可能是因为生物炭对土壤中硝态氮质量分数的影响因土壤质地不同而不同[14]。前人的研究发现，在添加生物炭的前2 a，显著提高土壤中的碱解氮质量分数[15-16]；在第4年与CK相比并未对土壤碱解氮质量分数的促进作用，这可能是因为施用生物炭后对土壤养分的影响仅仅停留在最初的1～2 a，随着时间的推移，生物炭对土壤养分的促进作用不断下降，Quilliam等[17]的发现也证实了这一想法。根据前人研究发现，在添加生物炭的前2 a，显著提高土壤中有机碳的质量分数[15,18]，而本研究中发现，在添加生物炭的第4年，只有T3显著提高土壤中的有机碳质量分数，CK与T1和T2的有机碳质量分数之间无显著差异，通过研究结果推论这可能与施用生物炭量的多少有关，施用生物炭量越大，则发挥生物炭土壤改良作用的时间就越长。根据本试验结果表明，生物炭的施用量在很大程度上影响着生物炭对土壤养分质量分数促进作用的时间，但具体影响还需进一步研究。

3.2 生物炭对土壤氨氧化菌和反硝化细菌的影响

土壤中的氮只有转化为硝态氮才能够被作物吸收利用[19]，农业生产上的氮肥主要以铵态氮的形式输入，而氨氧化菌将铵态氮先转化成亚硝态氮，亚硝态氮又经过亚硝化微生物的作用转化成硝态氮，从而完成整个硝化过程。因此，氨氧化过程是硝化过程的第一步，而在土壤硝化过程中氨氧化微生物担任驱动者的角色[20]。在添加生物炭4 a之后，T1和T2处理并未能显著提高土壤中氨氧化菌的丰度，而T3处理显著提高土壤中氨氧化菌的丰度，这与有关研究[21-23]的结果相一致，但CK处理下氨氧化菌与土壤氮素和有机碳均无显著相关性，这与邢肖毅等[24]的研究结果不一致，这很可能是因为大田生态系统中人为管理的情况下土壤中氮素质量分数会显著高于未施肥的土壤，而氨氧化菌微生物以氮素作为底物生长很可能在高肥力土壤上对氮素的响应不再敏感。

土壤硝态氮通过反硝化细菌转化成氮气。本研究中发现添加生物炭4 a之后显著提高土壤中nirS型反硝化细菌的群落丰度，而顾美英等[25]发现在灰漠土和风沙土上施加生物炭能降低土壤中反硝化细菌的群落丰度，这很可能是因为土壤质地不同而导致。本研究发现，在未添加生物炭的处理下，土壤中nirS型反硝化细菌的群落丰度与土壤铵态氮和有机碳呈极显著负相关，有机碳作为提供反硝化细菌的碳源直接影响土壤中反硝化细菌的群落丰度[26]；而在添加生物炭的处理下反硝化细菌群落丰度与土壤有机碳呈显著负相关，与土壤中的全氮和铵态氮质量分数呈极显著负相关，这很可能是因为生物炭的添加提高了土壤中的有机碳质量分数[27]，而本研究中生物炭的施用已有4 a，第4年中仅有T3处理下的土壤有机碳质量分数显著提高于CK，张娜[15]和曾爱等[16]的研究发现在前2 a生物炭处理均能显著提高土壤中有机碳的质量分数，因此反硝化细菌很可能在前3 a中开始适应高有机碳浓度的环境，所以与有机碳的相关性由CK的极显著负相关转变为显著负相关；另一方面添加生物炭会降低土壤体积质量[28]，从而增加土壤的通气性，而反硝化细菌是厌氧菌，在此基础上对原本有敏感响应的有机碳不再敏感，而对影响其反硝化过程氮素的响应敏感，具体原因还有待进一步对生物炭和氮肥的互作进行研究。

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(责任编辑：成 敏 Responsible editor:CHENG Min)

Long-term Effect of Application of Biochar on Physiochemical Properties and Microorganism of Loessial Soil

LIU Lu,WANG Ziting,LIU Yang,HAN Juan,LIAO Yuncheng and WEN Xiaoxia

(College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China)

In order to explore long-term effect of biochar on soil improvement,the field experiment was conducted with four biochar levels,including 0 kg/hm2(CK),1 000 kg/hm2(T1),5 000 kg/hm2(T2),and 10 000 kg/hm2(T3) four years ago,nitrogen and carbon mass fraction of soil was measured,and the abundance of soil microorganism was analyzed with Real-time PCR of amoA and nirS gene . The results showed that the amoA gene abundance in T2 and T3 were significantly higher than CK in early tilleringand jointing stage,and the nirS gene abundance of biochar treatments were significantly higher than CK inearly tillering,jointing stage and maturity. The soil nitrate nitrogen mass fraction in T2 and T3 were significantly higher than CK in jointing stage and maturity,meanwhile the soil ammonium nitrogen mass fraction in T3 was significantly higher than CK inearly tillering,jointing and maturity. The soil available nitrogen mass fraction in CK and T3 was respectively the maxium mass fraction inearly tillering and jointing stage,while the soil total nitrogen mass fraction in T3 and T1 was the maxiummass fraction in early tillering and flowering stage respectively and both were significantly higher than CK. The soil organic carbonmass fraction in T3 was the highest level in jointing,flowering stage and maturity,while there was no significance difference between CK,T1 and T2 in soil organic matter mass fraction.We found that after application of 1 000 kg/hm2and 5 000 kg/hm2biochar four years,the improvenment of soil nitrogen and carbon was no longer remarkable. Application of biochar had a long-term improvement on amoA gene abundance after four years. Adding 10 000 kg/hm2(T3) biochar to soil after years improved the nirS gene abundance significantly.

Biochar;Nitrogen; Carbon; amoA gene; nirS gene

LIU Lu,female，master student.Research area:efficient farming system.E-mail:15129399391@163.com

WEN Xiaoxia,female,Ph.D,professor.Research area:agro-ecology and efficient farming system. E-mail:wenxiaoxia6811@163.com

日期：2017-03-30

2016-09-01

2016-11-01

公益性行业(农业)科研专项(201503121-09)；陕西省科技统筹创新工程计划(2015KTZDNY01-02)；陕西省农业科技创新与攻关项目(2016NY-001)。

刘 露，女，硕士研究生，研究方向为高效农作制度。E-mail:15129399391@163.com

温晓霞，女，博士，教授，研究方向为农业生态和高效农作制度。E-mail:wenxiaoxia6811@163.com

S365

A

1004-1389(2017)04-0596-07

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170330.1509.030.html

Received 2016-09-01 Returned 2016-11-01

Foundation item Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest(No. 201503121-09);Shaanxi Science and Technology Innovation Project Plan(No. 2015KTZDNY01-02);Agricultural Science and Technology Innovation and Key Project of Shaanxi Province(No. 2016NY-001).