许 健，沈俊俊，黄秀芬，李永清

(北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097)

牛传染性鼻气管炎病毒致病机制研究进展

许 健，沈俊俊，黄秀芬，李永清*

(北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097)

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)主要引起牛的呼吸道、生殖道等炎症反应，也可以引起呼吸困难及流产。IBRV的致病机制尚不清楚，目前发现IBRV的非结构蛋白和结构糖蛋白与病毒毒力相关，不但影响病毒的复制及对宿主细胞的感染，同时也与病毒的免疫逃逸密切相关。除此之外，IBRV通过诱导宿主细胞凋亡造成持续性感染及激活炎症复合体诱导严重的炎症反应，造成宿主广泛病理反应的发生。因此，探索IBRV毒力蛋白结构功能、IBRV感染诱导的细胞凋亡及宿主炎性复合体激活的分子机制，将成为未来IBRV研究的热点。

牛传染性鼻气管炎病毒；毒力蛋白；细胞凋亡；炎症复合体

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)引起的一种急性、热性、接触性的牛传染病，在临床上主要表现为高热、呼吸困难、鼻炎和上呼吸道炎症，还可以引起脓包性外阴阴道炎、龟头炎、母牛流产、死胎及犊牛脑炎、共济失调，有时发生结膜炎和角膜炎等症状。IBRV属于疱疹病毒科(Herpesviridae)α疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirus)水痘病毒属(Varicellovirus)，又称之为牛疱疹病毒Ⅰ型(Bovine herpesvirus 1，BHV-1)。IBRV最为显著的致病特性为其对不同生长阶段牛的不同组织均能够造成严重损伤，根据感染组织器官的不同分为5种类型，即生殖道型、呼吸道型、眼型、脑膜炎型和流产型。IBRV通过感染宿主特定的细胞来引起机体的病理反应，如上呼吸道、扁桃体、结膜的上皮细胞及单核细胞、CD4+T 细胞、巨噬细胞等。IBRV感染宿主细胞的特性与其所含有的病毒蛋白及其诱导宿主细胞的病理反应有密切的关系[1]。本文就IBRV病毒相关致病蛋白与其所诱导的致病相关的分子机理研究进展进行综述。

1 IBRV毒力相关蛋白

IBRV感染宿主后要经过其编码的相关蛋白入侵细胞，其所编码的蛋白接近70个，编码基因分别位于病毒的长独特区(UL)和短独特区(US)。遗传分析表明，至少有30个基因对病毒的生长复制时非必需的，可以用作构建重组基因弱毒疫苗的候选，TK基因是最早鉴定的IBRV UL区的非必须基因，该基因主要编码IBRV胸腺激酶，是胸腺嘧啶合成途径必需的酶，是IBRV主要的毒力基因，其不参与病毒复制，但影响病毒在神经细胞中的持续感染，因此，研究者已开始相关TK基因缺失疫苗的研究[2-4]。gE蛋白也是病毒复制的非必须蛋白，影响病毒的释放及在细胞间的传递，该蛋白具有Fc受体活性，能够结合宿主所产生的IgG,对宿主的免疫造成影响[5]。除IBRV的非结构蛋白外，IBRV含有25个～33个结构蛋白，其中gB、gC、gH、gL、gM、gK、gG、gD、gI和gE是其主要的结构糖蛋白，其中gB、gC、gH、gL、gM和gK的编码基因位于病毒的长独特区，gG、gD、gI和gE的编码基因位于病毒的短独特区，这些糖蛋白与病毒入侵、复制、组装及释放扩散均有关联,gG蛋白在α疱疹病毒中相对保守，能够影响病毒在宿主细胞内有效增殖和细胞间的扩散，与病毒的毒力相关，其与病毒的所引起的免疫抑制密切相关[1,6-7]。gB蛋白是由74 ku和54 ku两个亚基以二硫键连接形成一个129 ku的蛋白质，gB蛋白有2个T细胞抗原表位，3个B细胞表位，是宿主免疫系统识别的主要为点，其在病毒引起的细胞融合中发挥重要作用[8]。gC蛋白在病毒的囊膜和病毒感染的细胞表面高度表达，说明gC蛋白在病毒的感染过程中发挥重要作用，该蛋白也是引起免疫反应主要的抗原作用位点，在促进病毒穿透细胞膜进入细胞的过程中发挥重要作用[9]。gD蛋白是病毒复制所必需的蛋白，是病毒囊膜的重要蛋白，主要参与病毒穿透细胞膜进入细胞，可以诱导强烈的体液免疫与细胞免疫，引起机体免疫系统产生的抗体可以中和病毒，是制备亚单位疫苗的首选蛋白[10]。而病毒的gH、gL和gI蛋白与病毒粒子的装配有关[11]。IBRV 进入宿主细胞后，利用其自身的结构或其非结构蛋白通过微管被运输到细胞核内，并利用宿主细胞所需蛋白来进行复制，病毒在离开核被膜后被包装上被膜，然后包在细胞小囊泡内被运输到细胞膜，最后释放到细胞外[12]。因此，研究IBRV的结构或非结构蛋白，在病毒复制及与宿主的相互作用，将为揭示IBRV致病机制的提供基础。

2 IBRV致病相关分子机制研究进展

2.1 IBRV诱导宿主细胞凋亡

IBRV感染宿主造成的免疫抑制及对组织细胞造成的组织细胞破坏，不仅引起宿主持续性感染及广泛的炎症反应，而且进一步造成其他病原体的继发感染，许多学者开展了相关IBRV感染与宿主细胞之间的相互关系研究。细胞凋亡是宿主细胞程序性死亡的过程[13]，不会造成宿主过于明显的病理变化，然而宿主细胞发生异常的细胞凋亡，将会对机体组织造成严重的病理过程，研究发现，许多病毒其利用其相关的蛋白改变宿主细胞的细胞凋亡进程，或增强细胞凋亡或抑制宿主的凋亡，造成宿主细胞病理变化。IBRV诱导的细胞凋亡与其致病机理相关。1998年Hanon E等[14-15]发现IBRV可以诱导T、B淋巴细胞及巨噬细胞的凋亡，这暗示着IBRV诱导的宿主免疫抑制可能与其诱导免疫细胞的凋亡相关，但具体作用机制尚需进一步研究论证。Hanon E等发现无论是完整的IBRV病毒粒子还是灭活后的IBRV病毒粒子均能够诱导牛细胞凋亡的发生，说明IBRV相关的结构蛋白可能是诱导细胞凋亡的重要因子。2012年Xu X等[16]发现IBRV可以通过上调凋亡基因的转录表达诱导牛中枢神经节细胞的凋亡，也可以通过其相关的蛋白配体与宿主细胞的死亡受体及线粒体途径相关蛋白结合诱导组织细胞的凋亡，可以看出，IBRV诱导的细胞凋亡不仅与其免疫抑制相关，而且与其持续性感染与致病性相关。IBRV糖蛋白gD是其重要的毒力因子[17]，是主要的诱导宿主细胞凋亡的IBRV结构蛋白之一，序列分析发现该蛋白含有与单纯疱疹病毒1型UL6蛋白区域相似的结构域，提示该蛋白可能与病毒的组装有关。2008年Fiorito F等[18]的发现2,3,7,8-tetrachlorodibenzop-dioxin可以通过宿主细胞的Bcl-2家族蛋白成员来调节IBRV诱导的细胞凋亡。2015年Gillet L等[19]发现牛4型疱疹病毒可以在体内外诱导人的A549 和 OVCAR细胞发生凋亡，宿主细胞出现病理变化。上述研究表明，IBRV诱导的细胞凋亡是导致机体病理变化的重要方面，是IBRV发挥致病作用的重要机理,研究IBRV诱导的细胞凋亡分子机制将为未来牛IBR的防控提供重要的依据。

2.2 IBRV激活炎症复合体

IBRV感染后除了诱导宿主细胞凋亡导致机体出现病理变化外，还引起持续性感染及广泛的炎症反应，引发牛只发生严重的鼻气管炎、结膜炎、脑膜脑炎、肠炎及生殖道相关炎症。炎症相关的细胞因子分泌是宿主利用天然免疫抵抗IBRV感染的重要方式，也对机体获得性免疫反应具有重要调控作用[1]。炎症复合体是宿主天然免疫细胞对胞内感染的各种病原微生物的一类蛋白复合体，通过识别各类入侵机体的病原相关分子模式(pattern recognition receptors,PAMP)和宿主衍生的危险相关分子模式 (damage-associated molecular pattern,DAMP)，活化胱天蛋白酶( cysteinyl aspartate-specific protease,caspase)-1、caspase-5等，诱导IL-1β、IL-18、IL-33 等促炎细胞因子的加工分泌调节炎症反应及免疫应答[20]。

IBRV除了通过呼吸道黏膜上皮及生殖道上皮感染宿主外，也可通过空气及牛与牛之间的接触进行传播。病毒一旦入侵细胞即可建立自身的复制体系，病毒感染宿主后，通过一系列方式建立感染[1]。最初发现疱疹病毒引起宿主细胞坏死的是单纯疱疹病毒-2(Herpes simplex virus-2， HSV-2)，Venincasa V D等[21]发现HSV-2感染性的病毒粒子可以明显抑制宿主细胞蛋白质以及核酸物质的合成，导致细胞坏死。Henderson G等[22]发现IBRV的bICP0蛋白可以通过降解宿主细胞IRF3抑制细胞IFN-I的转录抵抗天然免疫；疱疹病毒也通过其g C、g D蛋白与病毒通过这些方式抵抗宿主免疫反应。然而，宿主通过先天性免疫反应及获得性免疫反应来抵抗病毒的感染，如在IBRV感染早期，炎症反应及补体通路会被激活，而在病毒的复制过程中会刺激巨噬细胞、中性粒细胞等分泌IFN-γ，而这些炎性细胞因子即是是先天性免疫的重点，也是激活获得性免疫重要的诱发因素。Risalde M A等[23]对IBRV感染后的细胞IFN-γ、IL-1β、IL-12、IL-4和IL-10等细胞因子进行检测后发现，感染了IBRV的细胞呈现了较高水平的IFN-γ及IL-12的表达。以上研究表明，IBRV的感染与宿主炎性细胞因子所介导的免疫反应极为相关。

目前，关于疱疹病毒激活宿主炎性复合体机理的研究是该领域研究的热点问题之一。Hornung V等[24]发现鼠巨细胞病毒通过小鼠先天性免疫细胞AIM2激活炎性复合体，释放IL-18和IFN-γ；Kerur N等[25]发现在肉瘤相关疱疹病毒KSHV在感染过程中，宿主细胞的IFI16分子作为一个核病原体感知元件与ASC分子以及caspase-1 分子组成了炎症复合体，这一结果在人类的脐细胞及B淋巴细胞上进一步获得证实，而KSHV通过IFI16介导宿主免疫反应机制将为该病毒诱导的炎症及病理反应研究提供契机。Johnson K E等[26]发现人类单纯疱疹病毒在感染包皮成纤维细胞的2 h～4 h内，激活了IFI16和NLRP3依赖性的炎性复合体，其中IFI16识别HSV-1的基因组DNA后，重新在细胞浆中与ASC相互作用激活炎性复合体。然而，在感染后期，病毒编码ICP0蛋白，阻断了IFI16和NLRP3炎性复合体的活性，这表明在HSV感染的早期可以激活宿主细胞IFI16及NLRP3依赖性的炎性复合体发挥免疫作用，而在感染后期病毒则通过自身蛋白的编码关闭并逃避机体的这种免疫反应。2014年Wang J等[27]发现IBRV可以导致牛肾细胞系MDBK中caspase 1与IL-1的升高，表明IBRV可以激活宿主细胞的炎性复合体，可能是其重要的致病机理，但具体机制尚需进一步研究论证。以上研究说明不同病毒和不同宿主细胞所激活的炎症复合体在感染的不同时期内仍有不同，不仅与机体对病毒的抵抗有关系，也在病毒逃避宿主免疫系统的过程中发挥重要的作用，尤其在一些以急性炎症反应、败血症等为特征病毒性疾病中作用尤为重要。因此，在这种情况下研究IBRV诱导激活的炎症复合体的分子机制，将为解决IBRV诱发的临床广泛的炎症病理具有深远的意义。

3 结语

IBRV是牛重要的病毒性病原体，主要引起牛以呼吸道为主要特征的疾病，并伴有结膜炎、流产、乳腺炎，有时诱发小牛脑炎等。在国内外的养牛场广泛的流行，造成严重的经济损失，且目前尚无有效的疫苗防治该病在牛场的流行，同时也不能从根本上清除该病原体。因此，解析IBRV毒力蛋白结构、功能及与宿主的相互关系，同时研究IBRV感染导致的细胞凋亡机制及炎症反应与宿主炎性复合体激活机制，研究其与病毒感染的关系，将为揭示IBRV在养牛场的感染及致病机理提供新的途径，也将为解决IBRV引起的临床炎症反应及研制新型的抗IBRV感染类药物提供契机。

[1] Raaperi K,Orro T,Viltrop A.Epidemiology and control of bovine herpesvirus 1 infection in Europe[J].Vet J，2014,201(3):249-256.

[2] Kook I,Jones C.The serum and glucocorticoid-regulated protein kinases (SGK) stimulate bovine herpesvirus 1 and herpes simplex virus 1 productive infection [J].Virus Res，2016,222:106-112.

[3] Ostertag-Hill C,Fang L,Izume S,et al.Differentiation of BHV-1 isolates from vaccine virus by high-resolution melting analysis [J].Virus Res，2015,198:1-8.

[4] Ostertag-Hill C,Fang L,Izume S,et al.Differentiation of BHV-1 isolates from vaccine virus by high-resolution melting analysis.[J].Virus Res，2015,198:1-8.

[5] Zhang M,Fu S,Deng M,et al.Attenuation of bovine herpesvirus type 1 by deletion of its glycoprotein G and tk genes and protection against virulent viral challenge [J].Vaccine，2011,29(48):8943-8950.

[6] Raaperi K,Orro T,Viltrop A.Effect of vaccination against bovine herpesvirus 1 with inactivated gE-negative marker vaccines on the health of dairy cattle herds [J].Prev Vet Med，2015,118(4):467-476.

[7] Levings R L,Collins J K,Patterson P A,et al.Virus,strain,and epitope specificities of neutralizing bovine monoclonal antibodies to bovine herpesvirus 1 glycoproteins gB,gC,and gD,with sequence and molecular model analysis [J].Vet Immunol Immunopathol，2015,164 (3-4):179-193.

[8] Almeida G R,Goulart L R,Cunha-Junior J P,et al.A conformational epitope mapped in the bovine herpesvirus type 1 envelope glycoprotein B by phage display and the HSV-1 3D structure.[J].Res Vet Sci，2015,101:34-37.

[9] Pokhriyal M,Verma O P,Ratta B,et al.Bovine herpes virus 1 major immediate early transcription unit 1 (IETU-1) uses alternative promoters to transcribe BICP0 and BICP4 transcripts [J].Curr Microbiol，2016,72(4):420-425.

[10] Alves D L,Pereira L L F,van Drunen L,et al.Bovine herpesvirus glycoprotein D:a review of its structural characteristics and applications in vaccinology[J].Vet Res，2014,45:111. doi: 10.1186/s13567-014-0111-x.

[11] Khattar S K,van Drunen L D H S,Attah-Poku S K,et al.Identification and characterization of a bovine herpesvirus-1 (BHV-1) glycoprotein gL which is required for proper antigenicity,processing,and transport of BHV-1 glycoprotein gH [J].Virology，1996,219(1):66-76.

[12] Zhang K,Brownlie R,Snider M,et al.Phosphorylation of bovine herpesvirus 1 VP8 plays a role in viral DNA encapsidation and is essential for Its cytoplasmic localization and optimal virion incorporation [J].J Virol，2016,90(9):4427-4440.

[13] Vanden B T,Kaiser W J,Bertrand M J.Molecular crosstalk between apoptosis,necroptosis,and survival signaling [J].Mol Cell Oncol，2015,2(4):e975093.

[14] Hanon E,Pastoret P P.Apoptosis induced by bovine herpesvirus 1[J].Bull Mem Acad R Med Belg，1998,153(10-11):405-413.

[15] Hanon E,Lambot M,Hoornaert S,et al.Bovine herpesvirus 1-induced apoptosis:phenotypic characterization of susceptible peripheral blood mononuclear cells [J].Arch Virol，1998,143(3):441-452.

[16] Xu X,Zhang K,Huang Y,et al.Bovine herpes virus type 1 induces apoptosis through Fas-dependent and mitochondria-controlled manner in Madin-Darby bovine kidney cells [J].Virol J，2012,9:202.

[17] Hanon E,Keil G,van Drunen L D H S,et al.Bovine herpesvirus 1-induced apoptotic cell death:role of glycoprotein D [J].Virology，1999,257(1):191-197.

[18] Fiorito F,Marfe G,De Blasio E,et al.2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin regulates bovine herpesvirus type 1 induced apoptosis by modulating Bcl-2 family members [J].Apoptosis，2008,13(10):1243-1252.

[19] Gillet L,Dewals B,Farnir F,et al.Bovine herpesvirus 4 induces apoptosis of human carcinoma cell linesinvitroandinvivo[J].Cancer Res，2005,65(20):9463-9472.

[20] 周 洋，杨利峰，尹晓敏，等.炎症复合体的激活及调控研究进展[J].动物医学进展，2015,36(8):77-82.

[21] Venincasa V D,Emanuelli A,Leng T,et al.Acute retinal necrosis secondary to herpes simplex virus type 2 in neonates [J].Ophthalmic Surg Lasers Imaging Retina，2015,46(4):499-501.

[22] Henderson G,Zhang Y,Jones C.The Bovine herpesvirus 1 gene encoding infected cell protein 0 (bICP0) can inhibit interferon-dependent transcription in the absence of other viral genes [J].J Gen Virol，2005,86(10):2697-2702.

[23] Risalde M A,Molina V,Sanchez-Cordon P J,et al.Response of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines in calves with subclinical bovine viral diarrhea challenged with bovine herpesvirus-1 [J].Vet Immunol Immunopathol，2011,144(1-2):135-143.

[24] Hornung V,Ablasser A,Charrel-Dennis M,et al.AIM2 recognizes cytosolic dsDNA and forms a caspase-1-activating inflammasome with ASC [J].Nature，2009,458(7237):514-518.

[25] Kerur N,Veettil M V,Sharma-Walia N,et al.IFI16 acts as a nuclear pathogen sensor to induce the inflammasome in response to Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection [J].Cell Host Microbe，2011,9(5):363-375.

[26] Johnson K E,Chikoti L,Chandran B.Herpes simplex virus 1 infection induces activation and subsequent inhibition of the IFI16 and NLRP3 inflammasomes [J].J Virol，2013,87(9):5005-5018.

[27] Wang J,Alexander J,Wiebe M,et al.Bovine herpesvirus 1 productive infection stimulates inflammasome formation and caspase 1 activity [J].Virus Res，2014,185:72-76.

Progress on Pathogenetic Mechanism of Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus

XU Jian,SHEN Jun-jun,HUANG Xiu-fen,LI Yong-qing

(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,BeijingMunicipalAcademyofAgricultureandForestrySciences,Beijing,100097,China)

Infectious bovine rhinotracheitis (IBR) is caused by infectious bovine rhinotracheitis virus (IBRV) with the characteristic of severe inflammation,expiratory dyspnea and abortion in bovine，and is pandemic around the world and causing enormous economic losses.However,there is no available research for the pathogenetic mechanism of IBRV.Yet viral structural or non-structural proteins are associated with its virulence that have effect on IBRV replication，infection and immune escape. Moreover, IBRV can induce apoptosis on host cells, and can result in serious inflammatory response by activation of inflammasome, which can lead to persistent infection of IBRV and extensive pathophysiological process. Therefore, the exploration of structure and function of IBRV virulent protein(s), the mechanism of apoptosis induction and activation of inflammasome on infected host cells would be the focus on in the IBRV research area in the future.

Infectious bovine rhinotracheitis virus; virulent protein; apoptosis; inflammasome

2016-06-15

现代农业技术体系北京市奶牛创新团队岗位专家自助经费项目(bjcystx-ny-3)

许 健(1986- )，男，甘肃武威人，助理研究员，博士，主要从事畜禽疾病防控研究。*通讯作者

S852.659.1

A

1007-5038(2017)02-0075-04