陈 静, 冷 鹃, 杨喜爱, 廖丽萍, 肖爱平, 刘亮亮

中国农业科学院麻类研究所, 长沙 410205



磁性纳米粒子固定化酶技术研究进展

陈 静, 冷 鹃, 杨喜爱, 廖丽萍, 肖爱平*, 刘亮亮*

中国农业科学院麻类研究所, 长沙 410205

磁性纳米粒子因兼具磁学特性和纳米材料独特性能，被广泛应用于各个领域。就磁性纳米粒子的种类、特性、制备和表面修饰四个方面展开介绍,综述了脂肪酶、漆酶、淀粉酶及其复合酶等生物酶固定化酶技术的最新研究动态，针对磁性纳米粒子在固定化酶技术的研究应用现状进行了总结，以期为磁性纳米粒子固定化酶技术的应用研究提供参考。

磁性纳米粒子；脂肪酶；漆酶；淀粉酶；固定化酶

酶是具有生物催化功能的高分子物质，具有高效性、专一性、反应条件温和、无污染等特点[1]，在食品加工、药学和医学等研究领域中有着巨大的应用潜力。然而，大多数酶是蛋白质，其活性易受温度、pH等因素影响，且与底物产物的混合物不利于其回收，难以实现产物的分离纯化和连续化生产[2]。20世纪60年代迅速发展起来的固定化酶技术很好的解决了这些问题，有效提高了酶的利用率，并实现了产业化发展。其中，酶的固定载体和技术研究一直是酶固定化研究的核心问题，重点是寻找新的载体，确保固定后的酶保持其催化活性、催化特性和稳定性，同时，可实现高负载量和复合酶链式反应[3]。近几年，新型载体和技术有：交联酶聚集体[4]、“点击”化学技术[5]、多孔支持物[6]和以纳米粒子为基础的酶的固定化[7]等。纳米粒子作为酶固定化的新型载体，具有良好的生物相容性、比表面积大、颗粒直径小、较小的扩散限制、较高的载酶量及在溶液中稳定存在等优点[8]。粒子尺寸在1～1 000 nm范围内的球状或囊状结构的粒子常被用于酶的固定化，用于酶固定化的纳米载体材料可分为磁性纳米载体和非磁性纳米载体等[9]。本文综述了磁性纳米粒子的特性、制备方法及其在固定化酶技术研究领域的应用现状，以期为促进磁性纳米粒子固定化酶技术的应用研究提供参考。

1 磁性纳米粒子

纳米材料[10,11]的粒径尺寸为纳米级，通常介于1～100 nm之间。磁性纳米粒子[12,13]作为当今最受关注的一类纳米材料，其多功能磁性复合微球常被用于药物释放、生物大分子靶向分离等生物医学和分离工程相关领域的研究。

1.1 磁性纳米粒子的特性

磁性纳米粒子不仅具备表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应[14,15]4个基本普通纳米粒子效应，同时还具有特殊的磁学性质：超顺磁性、高矫顽力、低居里温度与高磁化率等[16～19]。

1.1.1 超顺磁性 超顺磁性是指磁性纳米颗粒尺寸小于临界尺寸时具有单畴结构，在较高温度下表现为顺磁性特点，但在外磁场作用下其顺磁性磁化率比一般顺磁材料大好几十倍，称为超顺磁性。超顺磁性即在有外加磁场时，材料表现为有磁性，当无外加磁场时，材料无磁性。故超顺磁性的纳米颗粒具有较好的分散性。

1.1.2 高矫顽力 强磁物质(如：铁磁体)一般在外加磁场减小为零时，其磁化强度不为零，剩余的磁化强度称为剩磁。矫顽力是指使剩磁减至为零而添加的反向磁场。矫顽力与成分、晶体点阵和取向等因素无关，其主要影响因素为点阵缺陷，即偏离理想晶体结构的程度。

1.1.3 低居里温度 带磁的磁性体会在某一温度因热失去磁性，这一温度称为居里温度。居里温度是物质磁性的重要参数，通常正比于交换积分，与间距和原子构型有关。纳米微粒的磁性常因小尺寸效应和表面效应发生变化，故其居里温度通常较低。

1.1.4 高磁化率 磁化强度M与磁场强度H之比称为磁化率，常用cm表示，即M=cmH。当cm>0，为顺磁质，当cm<0，为抗磁质，其值一般都很小。

1.2 磁性纳米粒子种类

磁性纳米粒子一般分为天然磁性纳米粒子和人工合成磁性纳米粒子。

人工合成磁性纳米粒子主要有：Fe、Co、Ni等[20]金属纳米粒子；Co3O4、Mn3O4等金属氧化物和各种铁氧化体纳米粒子等[21,22]。铁的氧化物能定期排出体外，对人体健康危害较小，具有良好的生理安全性，因此Fe3O4磁性纳米粒子多被用于生物医药领域[23]。

1.3 磁性纳米粒子制备

1.3.1 共沉淀法 共沉淀法[24]即向铁盐和亚铁盐混合液中，添加合适的沉淀剂，经加热发生共沉淀，制得超微粒的方法。共沉淀法制备得到的粒子尺寸较小，然而，制备过程中因水解平衡反应复杂，粒子的成核过程和生长过程会受到影响，因此得到的粒子有较宽的尺寸分布。总的来讲，该方法有较低的反应温度、简单的设备要求，且反应过程简单易控制，是制备磁性纳米粒子的主要方法。

1.3.2 高温分解法 高温分解法[25]是以高沸点有机物为溶剂，有机金属化合物为原料，经加热分解来制得纳米粒子的方法。利用高温分解法制备的磁性纳米粒子表面光滑，结晶度高，粒径小且粒径可控，粒径分布均匀。但此方法反应条件(高温高压)苛刻，设备要求高，反应体系为有机相，且经过表面处理后的合成粒子才能被转移到水相中。

1.3.3 沉淀氧化法 沉淀氧化法即二价铁盐在氧化剂作用下，发生部分氧化制备磁性纳米粒子的一种方法，常见的是以空气作为氧化剂氧化Fe(OH)2，李乾峰等[26]用NaNO3、NaClO3、KMnO4替代传统的空气作为氧化剂氧化Fe(OH)2制备Fe3O4磁性纳米粒子，研究了氧化剂、反应温度、反应液pH等工艺条件对制备的Fe3O4磁性纳米粒子粒径及磁饱和强度的影响，结果表明：Fe3O4磁性粒子粒径主要受氧化剂氧化能力和反应液pH的影响。与空气氧化制备的Fe3O4磁性粒子比较，采用NaNO3和NaClO3为氧化剂制备的Fe3O4磁性粒子均为球形，粒子形态与pH无关，且粒径大小相近时，有较高的比饱和磁化强度。

1.3.4 溶胶凝胶法 溶胶凝胶法[27,28]是制备金属氢氧化物及金属氧化物超微粒的方法。被用于溶胶凝胶法中作为前驱物的化合物要具备易蒸馏、重结晶技术纯化、可溶于普通有机溶剂、易水解等特性，金属醇盐作为前驱物被广泛用于溶胶凝胶法制备纳米氧化物材料。该方法具有反应物丰富、颗粒粒径均一、高纯度、粒径小、过程易控制等优点。

1.4 磁性纳米粒子表面修饰

磁性纳米粒子不仅具有纳米粒子特性，同时还具有特殊的磁学性能，近年来被广泛应用于生物分析等领域。但是，磁性纳米粒子粒径小、比表面积大、表面能高，为不稳定体系，易发生团聚，所以，需要对磁性纳米粒子表面进行功能化，降低其表面能，改善磁性纳米粒子的分散性及稳定性，同时使磁性纳米粒子的磁响应强度、表面活性和生物相容性等特性得到改善和提高。

1.4.1 有机小分子修饰 ①表面活性剂。表面活性剂含有长链基团，可以形成空间位阻，一方面可控制粒子的形态和尺寸，另外，可改善粒子的表面性能，从而起到稳定磁性纳米粒子的作用。油酸常被用来修饰Fe3O4，靳艳艳等[29]通过高温热解法得到油酸稳定的磁性纳米粒子，以高碘酸钠为氧化剂，氧化其表面的油酸，制备得到单分散羧基化 Fe3O4磁性纳米粒子，其粒径为12 nm，且粒径均一，在水中有良好的分散性，XRD和VSM表征结果显示，磁性纳米粒子的磁强度和成分在氧化制备羧基过程中基本不受影响。张晓闻等[30]采用改进的溶剂热法，以柠檬酸钠为稳定剂，制备出羧基功能化的Fe3O4磁性粒子，该粒子具有超顺磁性和高饱和磁化强度，磁响应性良好，可应用于磁性粒子偶联或复合。②硅烷化偶联剂。硅烷化偶联剂既有与磁性纳米粒子结合的Si-OH，又含有-NH2、-COOH、-SH、-CHO等能与生物分子结合的官能团。常被用于磁性纳米粒子表面修饰的硅烷化偶联剂有3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和3-巯丙基三乙氧基硅烷(MPTES)。付玉丽等[31]采用化学共沉淀法合成Fe3O4磁性粒子，通过APTES化学包裹得到有机硅表面修饰的Fe3O4磁性粒子，APTES-MNPs呈球形，粒径约17 nm，APTES-MNPs对刚果红染料的吸附符合Langmuir等温吸附模型，该粒子吸附性能好、易回收。

1.4.2 有机高分子修饰 ①天然生物大分子。目前，多糖类聚合物和氨基酸类聚合物是用于修饰Fe3O4磁性纳米粒子主要的天然生物大分子，利用天然生物大分子修饰的磁性纳米粒子其生物相容性得到大大的改善，且赋予复合材料新的生物活性。李璇等[32]以乙酰丙酮铁为铁源，聚乙二醇为溶剂，采用高温热解法制备聚乙二醇修饰的超顺磁性氧化铁磁性粒子PEG-SPIONs，后将糖酐Dex水溶液与PEG-SPIONs混合摇床培养得到Dex修饰的Dex/PEG-SPIONs复合粒子，该复合粒子为单晶体结构且分散性较好，具有超顺磁性，同时，Dex作为一种临时的血浆替代品具有很好的生物安全性，故Dex/PEG-SPIONs在生物医学等方面具有极好的应用前景。吴志超等[33]采用高锰酸钾为氧化剂氧化油酸包被的Fe3O4磁性粒子，制得表面包被有壬二酸的新型羧基磁性纳米粒子，该粒子表面羧基含量高且在水中具有良好的分散性，其水解后带负电荷，可与蛋白质表面带正电荷的氨基发生静电相互作用，这一新型的羧基功能化的超顺磁性纳米粒子吸附牛血清蛋白对固定化细胞、蛋白药物靶向载体和固定化酶载体的研究具有重要的指导意义。②合成高分子。利用不同的化学方法可合成不同需要的高分子修饰物用来修饰磁性粒子。邓啸[34]选用聚多巴胺修饰磁性纳米粒子，首先采用碱共沉淀法合成MNPs，多巴胺单体可在类似海水的碱性(pH 8.5)条件下发生自聚合作用，因此，通过调控pH可在MNPs表面形成一层聚多巴胺层，获得聚多巴胺修饰的磁性四氧化三铁纳米粒子(PD-MNPs)，该功能化磁性微球可有效的固定黑曲霉脂肪酶，固定化脂肪酶催化活性及稳定性较游离酶均有明显提高。

1.4.3 无机材料 用于Fe3O4磁性纳米粒子表面修饰的无机材料主要是SiO2，制备SiO2修饰的磁性纳米粒子的方法主要有：溶胶凝胶法、气溶胶高温分解法和反相微乳法。张慧勇[35]采用溶胶凝胶法制备Fe3O4/SiO2核壳结构复合纳米粒子，并对不同Fe3O4制备方法(共沉淀法、还原沉淀法和水热法)对应的Fe3O4/SiO2复合纳米粒子进行性能比较。其步骤如下：首先采用柠檬酸钠对纳米粒子进行表面修饰，然后在醇和水的混合体系中，碱性条件下催化正硅酸乙酯水解，磁性纳米颗粒表面被生成物包裹，制得的二氧化硅磁性复合微球具备小粒径核壳结构。结果表明，利用水热法制备Fe3O4粒子的分散效果最佳，包被效果较好，二氧化硅磁性复合微球在室温下表现出良好的稳定性。马丽等[36]采用溶胶凝胶法制备Fe3O4/SiO2复合纳米粒子，用3-APTES对Fe3O4/SiO2复合粒子进行氨基修饰，并用于漆酶的固定化。固定化酶在热稳定性、重复稳定性、pH稳定性方面均优于游离酶，同时，将固定化漆酶用于去除废水中的2,4-二氯酚，反应12 h，去除率最高为68.35%，该固定化酶重复使用12次后，对2,4-二氯酚的去除率可保持在52.85%。

2 磁性纳米粒子固定化酶技术的应用

通过共聚合表面修饰可将-NH2、-COOH、-OH、-CHO等多种功能基团赋予磁性纳米粒子表面，实现其功能化，因而具有强的磁响应性能、高比表面活性和良好的生物相容性，磁性纳米粒子已被广泛应用于生物化学领域，如天然产物中生物活性物质的分离，有害化合物的降解等。固定化酶技术[37]，即将游离酶束缚或局限在固定载体内，酶的生物活性及其特有的催化反应保持不变，并可实现回收重复利用的一类技术。固定化酶与游离酶相比有稳定性好、不易失活、可重复使用等优点，磁性纳米粒子作为固定化酶使用的固体材料，较其他固体材料具有独特的优势[38,39]：磁性纳米粒子的超顺磁性及强磁响应性能，可实现酶/底物及产物的快速分离，提高酶的使用效率；将酶固定于磁性纳米粒子可提高其稳定性；而且磁性纳米粒子巨大的比表面积可同时偶联多种生物酶，因此将分离技术和生物酶磁偶联用于多酶固定，可促进多酶链式反应的研究应用。

2.1 磁性纳米粒子在脂肪酶抑制剂筛选分离研究中的应用

Zhu等[40]采用共沉淀法制得Fe3O4磁性纳米粒子，硅酸四乙酯(TEOS)、(APTMS)作为硅烷偶联剂，-NH2/MNPs磁性粒子经二甲基甲酰胺(DMF)和10%丁二酸酐作用发生羧基功能化，获得-COOH/MNPs磁性复合粒子，此复合粒子可很好的与脂肪酶共价结合，酶活抑制实验表明，脂肪酶固定化酶(LMNPs)稳定性及活性较游离酶有明显提高。利用脂肪酶复合磁性粒子(LMNPs)成功的从莲叶提取液中分离出quercetin-3-O-β-D-arabinopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside和quercetin-3-O-β-D-glucuronide两种脂肪酶配体。Sahoo[41]采用溶剂热法，聚乙烯亚胺(PEI)、乙醇胺(EA)、(EDBE)为氨基前体，制得PEI-Fe3O4、EA-Fe3O4、EDBE-Fe3O4氨基化磁性粒子，分别与戊二醛交联剂作用，获得GLU-PEI-Fe3O4、GLU-EA-Fe3O4、GLU-EDBE-Fe3O4，磁性粒子表面的戊二醛与脂肪酶发生相互作用，实现脂肪酶的固定化。其中，EDBE-Fe3O4酶活性最高，是同等游离酶活性的83.9%，此外，EDBE-Fe3O4具有较好的热稳定性、储藏稳定性和重复利用性，其反应动力学参数与游离酶一致。这为脂肪酶的固定化提供了技术支持，同时，实现了脂肪酶抑制剂的快速筛选分离，为研发新的治疗肥胖的药物提供母体化合物。

2.2 磁性纳米粒子在α-淀粉酶配体筛选分离研究中的应用

交联酶聚集体(CLEAs)[42]是一种无载体固定化酶技术，是一种将基本纯化的、高浓度的蛋白先沉淀后交联形成不溶性的、稳定的固定化酶技术。较其他酶固定方法，该固定化方法不需要结晶、无需高纯度的酶，该方法可用于大多数酶或蛋白交联酶(蛋白)聚集体的制备，操作简便，应用范围广；获得的固定化酶活性高、稳定性好；无载体、单位体积活性大、空间效率高； Tudorache等[43]将氨基功能化的磁性纳米粒子加入酶溶液，将磁性粒子与酶液混合液进行沉淀、交联，制备了磁交联酶聚集体(MCLEAs)。功能化的磁性粒子可减少酶内赖氨酸残基数，提高酶聚集体的稳定性，同时赋予酶聚集体磁性以进行磁分离，提高酶的使用率。Liu等[44]通过合成α-淀粉酶磁交联酶聚集体从山茱萸果实中提取分离出Querciturone，其α-淀粉酶抑制活性IC50达22.5 μg/mL。

2.3 磁性纳米粒子在漆酶固定化研究中的应用

漆酶是一种对底物专一性要求较低且氧化还原能力较强的含铜多酚氧化酶，可氧化分解大部分有机污染物，如多环芳烃、多氯联苯、芳氨及其衍生物、染料、色素、炸药等[45]。漆酶主要分布在植物、菌类和微生物中。由于漆酶氧化分解有机物所需条件温和、最终反应产物为水、无污染、来源丰富等优点，在环境保护、造纸业、生物传感器等领域得到广泛研究。然而，游离漆酶稳定性差，且重复利用率低，限制了其在工业中的应用。为克服游离漆酶的缺点，实现漆酶的工业化应用，漆酶固定化技术研究尤为重要，磁性纳米粒子作为近年来酶固定化材料之一，成为漆酶固定化研究的热点。

欧阳科等[46]通过化学交联法将漆酶固定在磁性石墨烯载体上，对固定化漆酶的酶学特性及其对双酚A(BPA)的降解功能进行了考察。结果表明，经石墨烯固定后漆酶的耐酸性、耐热性和稳定性有显著提高，漆酶固定后其重复利用性得到改善，重复利用10次后，漆酶活性仍为最初活性的82.01%。固定化酶的米氏常数Km为5.38×10-4mol/L，较游离酶的大，说明固定化酶与底物的亲和力比游离酶小，固定化漆酶对双酚A具有良好的分解能力，水中BPA质量浓度为15 mg/L时，经过18 h反应，BPA的去除率能达到82.14%左右。

Xia等[47]分别制备了氨基化四氧化三铁漆酶固定化酶(Fe3O4-NH2-laccase)和氨基-聚乙烯亚胺四氧化三铁漆酶固定化酶(Fe3O4-NH2-PEI-laccase)，并分别考察了它们的酶学活性和反应动力学参数。结果表明，两种固定化酶较游离酶，酶活性、酶稳定性、酶利用率都明显提高，且对酸的适应能力、热稳定性、储藏稳定性等都有提高；Fe3O4-NH2-PEI-Laccase较Fe3O4-NH2-Laccase有较高的吸附容量和酶活性，Fe3O4-NH2-PEI-Laccase可实现漆酶大量的固定化，更有希望实现漆酶的工业化。

2.4 磁性纳米粒子在多酶链式反应中的应用

磁性纳米粒子巨大的比表面积可实现多种生物酶的同时偶联，将分离技术和生物酶磁偶联应用于多酶固定，促进多酶链式反应的研究应用。果汁生产中，颜色、澄清度、口感等是衡量果汁是否合格的重要指标。影响这些指标的因素主要有：细胞壁和细胞质中果胶胶态分散体、淀粉、纤维素和半纤维素等多糖。这些大分子的存在是造成果汁浑浊、口感差的主要原因，而淀粉酶、果胶酶和纤维素酶可以将这些生物大分子分解为小分子，能够有效改善果汁外观和品质。Sojitra等[48]通过共沉淀法合成Fe3O4磁性粒子，以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为氨基源对Fe3O4氨基化修饰，以戊二醛为交联剂，将功能化磁性粒子与酶混合液混合孵育，淀粉酶、果胶酶、纤维素酶分别与磁性粒子结合并固定，制得磁性复合酶纳米生物催化剂。该磁性复合酶纳米生物催化剂在热稳定性、pH稳定性、重复利用性等酶学活性及反应动力学参数Km较游离酶都有明显提高。利用该磁性复合酶纳米生物催化剂分别进行葡萄、苹果和梨果汁浑浊实验，混合反应150 min后，浑浊度分别降低为46%、41%和53%，结果表明，这一磁性复合酶纳米生物催化剂可替代传统果汁的生产方法应用于果汁的工业化生产中。

3 展望

综上所述，磁性纳米粒子固定化酶技术已在生物医药、食品、环境保护等领域被广泛应用，并取得了一些重要成就，但仍存在一些需要解决的问题，主要有以下几个方面：①目前，关于磁性纳米粒子固定化酶研究主要集中在脂肪酶和蛋白酶上，其他酶类研究甚少，且磁性纳米粒子固定化酶方法具有局限性，只适用于一类酶或几种酶的固定化；②功能化磁性粒子固定化酶通常存在固定化酶含量较高、而固定化酶活性较低的问题，解决这一问题，对于提高酶使用率、降低成本、实现工业化大规模操作至关重要；③目前，国内外学者对磁性粒子固定化酶条件优化研究较多，针对磁性粒子与酶作用机制研究较少，磁性粒子固定化酶作用机制有待进一步研究，为磁性粒子的改性和选择提供了重要依据；④以磁性粒子固定化酶为催化剂进行催化反应的反应机制需深入研究，以实现磁性粒子固定化酶技术的广泛应用。总之，磁性纳米粒子固定化酶是一个正在蓬勃发展的研究领域，发展更为高效的方法制备磁性纳米粒子固定化酶仍是有待深入研究和具有挑战性的研究课题。

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Progress on Magnetic Nanoparticles Immobilized Enzymes

CHEN Jing, LENG Juan, YANG Xiai, LIAO Liping, XIAO Aiping*, LIU Liangliang*

InstituteofBastFiberCrops,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Changsha410205,China

Magnetic nanoparticles with magnetism characteristics and the special performance of nanomaterials, are widely applied in many kinds of fields. This paper reviewed progress on the magnetic nanoparticles, including types, features, preparation and surface modification. The paper also summarized the latest development of immobilized enzyme technology of lipase, lactase, amylase and a combination of two or more, which was aimed to provide reference for the study of magnetic nanoparticles immobilized enzymes.

magnetic nanoparticles; lipase; laccase; amylase; immobilized enzymes

2017-03-31; 接受日期：2017-05-18

国家农产品质量安全风险评估项目计划(GJFP201701003)资助。

陈静，硕士研究生，研究方向为农产品标准与检测技术。E-mail：15616200178@163.com。*通信作者：肖爱平，研究员，主要从事农产品质量安全风险评估研究。E-mail：xap5@sina.com;刘亮亮，助理研究员，主要从事天然产物活性成分分析研究。E-mail：liuliangliang@caas.cn

10.19586/j.2095-2341.2017.0022