郭 枫, 刘焕焕, 邱智东, 王伟楠

长春中医药大学药学院, 长春 130117



稀有人参皂苷的酶转化研究进展

郭 枫, 刘焕焕, 邱智东, 王伟楠*

长春中医药大学药学院, 长春 130117

人参皂苷是五加科人参属植物的主要活性成分之一。研究表明，人参皂苷经过体内代谢后生成的稀有皂苷在抗肿瘤、抗炎、抗衰老等方面的药理作用要强于原型皂苷，因此，稀有皂苷的制备成为目前人参研究领域的热点内容。人参皂苷的酶转化是稀有人参皂苷制备的主要途径之一，近些年取得了突破性的进展，以不同种类的糖苷酶为切入点，将相关研究内容进行了综述，分别讨论了不同类型的糖苷酶在稀有皂苷生物转化过程中的应用，以期为稀有皂苷的大规模开发利用奠定基础。

稀有人参皂苷；酶转化；糖苷酶

人参(PanaxginsengC.A Mayer)为五加科人参属多年生草本植物,作为我国传统名贵中药材在国内外已被广泛应用[1]。人参的主要成分包括皂苷、多糖、挥发油和蛋白质等[2]。现代药理学研究表明，人参皂苷是人参作用于心脑血管系统、神经系统、免疫系统以及内分泌系统的主要物质基础[3]。随着相关研究的进一步深入，研究人员发现，在人参属植物中含量较低甚至无法检出的稀有皂苷才是人参药材中可被吸收入血的主要活性成分，如人参皂苷 Rg3、Rh2和人参皂苷化合物K(CK)等。与人参药材中含量较高的皂苷相比，稀有皂苷在抗肿瘤、调节机体免疫力、保护神经系统等方面的疗效更为显著，生物利用度更高[4]，因此具有极高的药用开发价值和广阔的应用空间。然而，稀有皂苷缺乏稳定的来源，这是其开发利用的首要难题[5]。近年来，各领域的研究者们不断尝试着通过组织培养、化学合成和生物转化等方法为人参皂苷提供新的来源，虽然取得了一定的进展，但这些方法仍然存在各自的问题，限制了其应用[6]。

然而，生物转化法制备稀有人参皂苷相较于其他方法仍具有较大优势[7]。截至目前，人参皂苷生物转化主要有两种方式：微生物转化和酶转化。虽然微生物转化法操作相对简单、成本较低，但遗传稳定性和生物安全性存在一定问题；另一方面，酶相对于微生物具有更高的转化效率和更好的专属性[8]。因此，利用酶转化法生产制备稀有皂苷具有良好的发展前景。本文将以不同类型的酶为切入点，对近年来稀有皂苷的酶转化制备的相关研究加以综述，为其进一步开发利用和扩大药源提供参考。

1 原人参二醇(protopanaxadiol,PPD)型皂苷的酶转化

1.1 人参皂苷化合物K(CK)的酶转化制备

人参皂苷CK是PPD型人参皂苷经体内代谢后生成的主要代谢产物，具有较强的抗肿瘤活性[9]。目前，关于人参皂苷CK生物转化的研究报道较多，从整体上看，利用酶转化制备人参皂苷CK的效率要高于微生物和细胞，因此，关于人参皂苷CK转化酶的挖掘与研究引起了科研人员的广泛关注。能够转化生成人参皂苷CK的酶主要来源于两种，一是微生物分泌酶，二是已经商品化的糖苷酶[10～12]。无论哪种酶，其对转化底物的选择性及催化效率均有所不同。目前已报道的人参皂苷CK转化底物包括人参皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd等[13,14]，其中人参皂苷Rb1在自然界中含量较高，成本较低，是人参皂苷CK最常用的转化底物[15]。从结构上看，将人参皂苷Rb1转化生成人参皂苷CK需要脱掉3个糖基，分别是C3位的两个葡萄糖基和C20位末端的一个葡萄糖基，而不同的糖苷酶催化这3个糖苷键水解的难易程度和先后顺序也有所区别，这就形成了不同的转化途径。就人参皂苷Rb1而言，其转化生成人参皂苷CK的途径主要有两条：人参皂苷Rb1→Rd→F2→CK和人参皂苷Rb1→七叶胆皂苷 XVII→F2→CK[16,17]；同时，人参皂苷Rb2也发现了两条转化生成人参皂苷CK的途径，分别为：人参皂苷Rb2→CO→CY→CK和人参皂苷Rb2→Rd→F2→CK[18]。不同的转化途径源于不同转化酶的催化特性，可以根据这些特点来设计不同的转化工程酶，针对特定位点的糖基进行水解，以产生相应的稀有皂苷来满足医药市场的需求[19]。除了转化途径上的区别，不同酶的转化效率对于人参皂苷CK的制备也很重要。酶转化法相对于化学合成法和其他方法的优势主要体现在专属性强和转化效率高两方面，近几年发现的人参皂苷CK转化酶，其摩尔转化效率一般高于80%，从而使产物的背景比较简单，易于将人参皂苷CK与其他杂质分离，从而得到高纯度的人参皂苷CK产品，这对于人参皂苷CK的大规模生产制备及应用开发有着重要的意义[13,20]。

1.2 人参皂苷Rg3的酶转化制备

人参皂苷Rg3也是人参中主要的抗肿瘤活性成分，能较好的抑制肿瘤细胞的生长和转移，目前已经开发成为临床使用的一线药物。因为末端糖基相较于苷元直接相连的糖基更易被水解，所以在保持C3位所连糖链结构不变的基础上，定向水解C20位的糖基生成Rg3显得尤为困难[21]。目前，已有研究者在自然界中筛选出可以用PPD型皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd作为底物转化生成Rg3的酶，其转化途径主要为：人参皂苷Rb1、Rb2→Rd→20(S)-Rg3[22,23]。在多数情况下，这些水解反应很难保持严格的结构专属性，往往会产生很多非Rg3的副产物，但通过酶学研究和分子结构优化，可以实现定向稳定的转化生成人参皂苷Rg3的目的。

1.3 其他PPD型皂苷的酶转化研究

由于PPD型皂苷的糖基主要连接在C3位和C20位，这两个位置糖苷键的水解难度较低，因此已发现了大量的PPD型皂苷转化酶。从近些年的文献报道来看，多数PPD型皂苷转化酶来源于微生物，其中一些转化酶的专属性较强，能够特异性水解PPD型皂苷的糖苷键，而当以原人参三醇(PPT)型皂苷为底物进行转化时，则不能发生糖苷键水解反应[24]；还有一些PPD型皂苷水解酶的结构选择性差异较大[25]，这决定了即使转化相同的人参皂苷底物，转化产物也不尽相同。以人参皂苷Rb1为例，在结构选择区域不同的催化酶作用下，可转化生成F2、Rd、Rh2等不同的稀有皂苷，其中个别反应的摩尔转化率可达到90%左右[26～29]。这种情况的出现取决于相应转化酶功能域的结构，通过对这些结构中的关键氨基酸残基进行深入研究，可以为有目的性的设计合成不同的皂苷转化工程酶提供依据。

2 原人参三醇(protopanxatriol,PPT)型皂苷的酶转化

2.1 人参皂苷F1的酶转化制备

虽然PPT型人参皂苷与PPD型人参皂苷结构较为相似，仅仅是羟基数量和苷键原子连接位置的不同，但其转化酶的活性和专属性却有较大的区别，C6位的糖苷键相较C3位和C20位的糖苷键较难被水解。人参皂苷F1就是通过水解人参皂苷Rg1 C6位糖苷键之后生成的稀有皂苷，由于该反应难度较大，目前相关文献报道较少。虽然已发现一些可以转化人参皂苷Rg1生成F1的酶，但多数都能同时水解C6位和C20位的糖苷键，导致F1的转化生成效率较低[30,31]。通过基因调控、重组酶纯化和转化条件的优化等方法可以极大的改善人参皂苷F1的转化效率问题，一些研究者通过上述操作将人参皂苷F1的转化生成效率提高到80%以上，甚至可以将人参皂苷Rg1几乎完全转化为稀有皂苷F1[32～34]。

2.2 人参皂苷Rh1的酶转化制备

稀有皂苷Rh1是PPT型皂苷中最具代表性的活性成分之一，其转化酶多来源于真菌和细菌，前者研究报道较多。人参皂苷Rh1与F1是同分异构体，主要的区别在于糖基连接的位置不同，人参皂苷Rh1的糖基连接在C6位，因此可以通过水解Rg1的C20位葡萄糖基、Rf的C6位末端葡萄糖基、Rg2的C6位末端鼠李糖基以及Re的C20位葡萄糖基和C6位的末端鼠李糖基来制备。通过实践，研究者们发现人参皂苷Re和Rg2的C6位末端鼠李糖基相较葡萄糖基更难于酶解，因此用于人参皂苷Rh1酶转化制备的底物以Rg1和Rf为主，近几年的相关报道也多是围绕这两种人参皂苷的生物转化展开的[35～38]。

2.3 其他PPT型皂苷的酶转化研究

目前发现的皂苷转化酶以PPD型糖苷酶为主，PPT型糖苷酶则相对较少。已报道的PPT型糖苷酶除了可以转化特定底物生成人参皂苷F1和Rh1之外，还可以转化人参皂苷Re、R1、Rf等生成Rg1和Rg2，且酶的选择性较好，转化率较高，具备一定的工业应用价值[39～41]。然而，有研究发现，某些PPT型糖苷酶的催化特性与培养基中所加金属离子的种类和含量相关，例如，从人参土壤微生物MicrobacteriumesteraromaticumGS514的液体培养基中分离出一种受Na+诱导的粗酶，当没有Na+存在时该酶催化水解人参皂苷Rg1生成F1，而当反应体系中加入Na+时，Rg1则被定向转化成稀有皂苷Rh1和PPT苷元，同时在该条件下，该酶还可将Re特异性转化为Rg2，这一发现为人参皂苷转化酶的反应条件优化提供了新的思路[42]。

3 展望

人参皂苷具有极强的生物活性，其药理作用与化学结构存在必然的联系，因此人参皂苷的结构修饰可以为相关新药和健康产品的开发提供新的来源和途径，是人参研究领域中非常热门的一项工作。目前人参皂苷结构修饰的方法主要为化学法和生物法，各有利弊。但从发展趋势来讲，生物合成与转化因其环境友好、专属性强、催化效率高等优点被科研人员所看好。酶转化是人参皂苷结构修饰的一种重要途径，目前研究主要集中于糖苷键的水解，通过不同位置糖链结构的变化来改善化合物的生物活性，以满足人们的医药保健需求。目前，可以通过多种途径获得不同的人参皂苷糖苷酶，但很多酶的结构立体选择性不好，催化效率也较低，不能实现工业化的生产，限制了其应用。因此，从自然界中挖掘具有不同底物选择性和催化活性的糖苷酶，以及研究不同糖苷酶对底物的催化机制，对于人参皂苷生物修饰及合成工程酶的开发具有极其重要的作用。本文综述了近几年人参皂苷糖苷酶的发现及活性研究文献，希望借此为相关领域的研究提供一些参考和理论依据，为稀有人参皂苷研究体系的构建提供有力的支撑。

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Advances in Enzymatic Transformation of Rare Ginsenosides

GUO Feng, LIU Huanhuan, QIU Zhidong, WANG Weinan*

SchoolofPharmaceuticalSciences,ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130117,China

Ginsenosides are one of the main active components of the plants, which belong to the genusPanaxof Araliaceae family. Studies have shown that the pharmacological effects of rare saponins, produced by metabolisminvivo, on anti-tumor, anti-inflammatory and anti-aging are stronger than those of the prototype saponins. Therefore, preparation of rare saponins has become a popular topic in the field of ginseng research. Enzymatic transformation of ginsenosides is one of the primary ways for the preparation of rare saponins, in which many breakthroughs have been made recently. In this paper, the results of these studies were reviewed from the perspectives of different glycosidase types as well as their applications in rare saponins biotransformation so that it could lay a solid foundation for the large-scale development and utilization of rare saponins.

rare ginsenosides; enzymatic transformation; glycosidase

2017-03-21; 接受日期：2017-03-31

吉林省重大科技攻关项目(20160201001YY)资助。

郭枫，硕士研究生，研究方向为中药学生物转化。E-mail：1591421587@qq.com。*通信作者：王伟楠，副教授，博士，主要从事中药化学研究。E-mail：306172031@qq.com

10.19586/j.2095-2341.2017.0017