许 永, 蒋次清, 李 超, 吴亿勤, 张 丹,邹 楠, 张承明, 秦云华, 缪明明, 蒋 薇

(云南中烟工业有限责任公司技术中心, 云南 昆明 650231)

研究论文

气相色谱-三重四极杆质谱法同时测定烟丝中73种香气物质

许 永, 蒋次清, 李 超, 吴亿勤, 张 丹,邹 楠, 张承明, 秦云华, 缪明明, 蒋 薇*

(云南中烟工业有限责任公司技术中心, 云南 昆明 650231)

建立了气相色谱-三重四极杆质谱(GC-MS/MS)同时测定烟丝中73种香气物质的分析方法。样品用无水乙醚振荡提取,提取液经过滤后直接进入DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)分离,通过优化质谱参数,可有效降低复杂基质和重叠峰的干扰,同时采用多反应监测(MRM)模式测定,内标法定量。结果表明,目标物在各自的线性范围内线性关系良好(r2>0.99),低、中、高3个水平的加标回收率为70.0%～122.3%,相对标准偏差(RSD)为1.6%～20.4%。该方法具有前处理简单、准确灵敏的特点,适用于烟丝样品中73种香气物质的检测。

气相色谱-三重四极杆质谱;多反应监测;烟丝;香气物质

烟支的香气成分是卷烟产品的“灵魂”,是风格特征形成的奥秘所在。因此测定卷烟烟丝中致香成分的含量,对于研究卷烟的吸食品质和生产优质的卷烟具有重要的指导意义。目前,国内外有关烟草香气物质的前处理方法有溶剂提取[1,2]、水蒸气蒸馏[3-5]、同时蒸馏萃取(SDE)[6-8]、加速溶剂萃取(ASE)[9,10]、固相微萃取(SPME)[11-14]、超临界流体萃取(SFE)[15,16],分离技术有吹扫捕集[17]、顶空分析[18-20]等。其中,溶剂提取法是一种常用的前处理方法,具有操作简单、能耗低、选择性高、分离效果好的优点。气相色谱-质谱联用技术因其分离效率好、灵敏度高、检出限低,并能同时完成定性和定量分析等特点,被广泛应用于烟草中挥发性成分的检测[8,10,12,15,17,18,20]。而三重四极杆质谱因其具有更高的灵敏度,可大大简化卷烟样品的前处理过程,比单四极杆质谱具有更强的特征离子选择性,可极大地降低背景干扰,提高检测结果的准确性。目前,气相色谱-三重四极杆质谱法(GC-MS/MS)在农残方面的应用较多[21-23],但在烟草化学领域的应用则较少。本研究采用溶剂萃取直接进样-气相色谱-三重四极杆质谱法测定烟丝中73种香气物质,建立的方法重复性、回收率和检出限均令人满意。通过GC-MS/MS技术对烟丝中的香气成分进行定性和定量分析,可以更准确地了解烟丝中每一香气成分的变化,是一种有效的质量控制手段,同时也可为新产品的研发提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

SCION 456 GC-TQ气相色谱-三重四极杆质谱仪(美国Bruker公司); AG135型电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司); GFL3017振荡摇床(德国Burgwedel公司)。

73种香气物质标准品(纯度95%～99%)均购自加拿大TRC公司、1,2-丙二醇(纯度99%)、萘(纯度99%)均购自北京百灵威科技有限公司;无水乙醇(色谱纯)购自德国Merck公司;无水乙醚(分析纯)购自广州汕头西陇试剂厂。6种品牌的卷烟样品,分别编号为A、B、C、D、E、F,由云南中烟工业有限责任公司提供。

1.2 标准溶液的配制

准确称取6 g萘,置于100 mL容量瓶中,用无水乙醚稀释并定容,配制质量浓度为60 g/L的内标储备液;移取0.1 mL内标储备液于100 mL容量瓶中,用无水乙醚稀释并定容,配制质量浓度为60 mg/L的内标标准工作液。

分别称取香气物质标准品各0.005 0 g(或0.01 g)于不同的50 mL(或100 mL)容量瓶中,用无水乙醇-1,2-丙二醇(9∶1, v/v)溶液定容,配制质量浓度为100 mg/L的标准储备液;用无水乙醚稀释各标准储备溶液,并配制适当质量浓度的系列标准工作溶液(配制5级),并在其中加入适量内标标准工作液,保证内标萘的质量浓度为6 mg/L。

上述所有溶液均于4 ℃冰箱中保存,使用前恢复至室温。

1.3 样品前处理

随机抽取10支新开封的同一品牌的烟支,剥去卷烟纸和滤嘴,取出烟丝,混匀,称取3份0.6 g(精确至0.000 1 g)烟丝,分别放入3个50 mL锥形瓶中,作为试样。在试样中分别加入1 mL 60 mg/L的内标标准工作液、9 mL无水乙醚,迅速盖上玻璃塞,摇匀,置于振荡摇床,以150 r/min的振荡频率、30 mm的振荡幅度振荡2.0 h后,用10 mL针筒吸取上层萃取液,经0.22 μm微孔滤膜过滤,供仪器分析。

1.4 仪器条件

色谱柱:DB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm);进样口温度:250 ℃;流速:1 mL/min;分流比:10∶1;升温程序:初始温度50 ℃,保持2 min,以5 ℃/min升温至250 ℃,保持20 min；总分析时间：62 min。

离子源:EI源;离子源温度:170 ℃;传输线温度:250 ℃;电离能:70 eV;灯丝电流:80 μA;碰撞气:氩气(纯度99.999%);检测模式:多反应监测(MRM)模式;每个离子的检测时间:100 ms。

2 结果与讨论

2.1 香气物质的选择

通过文献调研、业内项目研究和相关专家指点,本实验共筛选出包括烟草中的香味物质、烟气中的香味物质和对15种感官香韵指数有贡献的73种香味物质作为研究对象。

2.2 质谱参数的优化

先以全扫描方式确定每一种香气物质的保留时间,并且选择出适当的母离子,再利用PRODUCT扫描模式,通过碰撞池使母离子裂解产生子离子,并对选择的母离子进行二次质谱分析,采用MRM模式对其各自的碰撞能量电压(CID)进行优化,最终确定出定性离子对、定量离子对和各个物质的二级质谱参数。73种香气物质的保留时间、定性和定量离子对及碰撞能量见表1。

2.3 萃取溶剂的选择

分别准确称取7份同一品牌卷烟的烟丝(精确至0.1 mg)于50 mL锥形瓶中,分别以石油醚、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、异丙醇、甲醇和丙酮为萃取溶剂,考察样品总出峰个数及总峰面积,结果见图1。

表 1 73种香气物质及内标的保留时间(tR)、定性离子对、定量离子对和碰撞能量(CE)

表 1 (续)

* Internal standard substance.

图 1 萃取溶剂对色谱峰数和总峰面积的影响Fig. 1 Effect of extraction solvents on the total numbers and areas of chromatographic peaks

图 2 萃取时间对色谱峰数和总峰面积的影响Fig. 2 Effect of extraction times on the total numbers and areas of chromatographic peaks

由图1可以看出,当乙醚为萃取溶剂时,总出峰数最多,说明可以检测出的香气物质的种类最多,而且色谱响应也较高。实验所用色谱柱是DB-5MS柱,以乙醚为萃取溶剂时,不会对色谱柱造成损害。综合考虑,本实验选择乙醚作为萃取溶剂。

2.4 萃取时间的选择

分别准确称取6份同一品牌的卷烟烟丝(精确至0.1 mg),按1.3节进行处理,置于振荡摇床,分别振荡0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h,考察萃取时间对样品出峰个数和总峰面积的影响,结果见图2。实验发现,当萃取时间超过1.5 h时,检测到的化合物个数相近,待测组分在2.0 h时的色谱响应值最大。综合考虑分析时间和萃取效率,本实验选取2.0 h作为样品的萃取时间。

2.5 定性与定量方法

本方法采用“保留时间+定性、定量离子对+相对丰度比”三重方式进行定性。在相同的实验条件下,如果样品色谱峰的保留时间和标准品色谱峰的保留时间一致,并且样品质谱图中所选择的离子对均出现,离子对的相对丰度比与标准品中离子对的相对丰度比一致,则判定样品中存在该种香气物质。采用内标法定量,减少了实验过程的不确定性及仪器的不稳定性对样品测定的干扰,使定量结果更加准确。2.6 线性关系、检出限与定量限

采用本方法对73种香气物质的系列标准工作液进行测定,以各组分与内标峰面积的比值为纵坐标(Y)、对应各组分与内标物质量浓度的比值为横坐标(X)绘制标准曲线,73种香气物质在其各自的线性范围内线性关系良好,相关系数(r2)均大于0.99(见表2)。

将1.2节制备的73种香气物质的混合标准储备液分别稀释不同倍数后,以信噪比(S/N)为3和S/N为10时，定量离子信号对应的样品含量计算检出限(LOD)和定量限(LOQ),分别为0.002 0～7.854 8 μg/g和0.006 5～26.182 6 μg/g。具体结果见表2。

表 2 (续)

Nos. 1-73 are the same as in Table 1.y: peak area ratio of target analyte to the internal standard;x: mass concentration ratio of target analyte to the internal standard.

2.7 回收率和精密度

为验证方法的准确性,对卷烟烟丝样品进行了低、中、高3个水平的加标回收率试验,按1.3节所述进行前处理,每个添加水平做5个平行样品,分别测定73种香气物质的含量,并根据加标量、加标前和加标后的测定结果计算加标回收率和相对标准偏差(RSD)。73种香气物质的回收率为70.0%～122.3%, RSD为1.6%～20.4%(n=5)。

2.8 实际样品分析

按建立的方法分析6个不同品牌(A～F)的卷烟烟丝样品,其中A样品的MRM总离子流色谱图见图3。A～F卷烟烟丝样品的检测结果见表3，可以看出,5-甲基糠醛、芳樟醇、γ-庚内酯、α-松油醇、香芹酮、香叶醇、乙酸芳樟酯、4-甲基-2-苯基-1,3-二氧戊烷、反式-肉桂醛、δ-壬内酯、肉桂酸乙酯11种香气物质在该6种品牌卷烟烟丝中均未检出;2-甲基吡嗪、戊酸乙酯、3-乙基吡啶、苯甲醛二甲缩醛4种香气物质只存在于F品牌烟丝中;对茴香醛只存在于C品牌卷烟烟丝中。

图 3 A样品的MRM总离子流色谱图Fig. 3 MRM total ion chromatogram of the sample A

No.Contents/(μg/g)ABCDEFNo.Contents/(μg/g)ABCDEF14.09-3.683.714.043.89380.370.370.38-0.390.3920.130.140.220.200.180.18390.540.500.450.570.610.523-0.01-0.090.080.1340------40.230.250.310.310.320.3341-0.26--0.290.3452.532.472.512.772.612.5142------635.9336.8539.6840.2438.0835.9843--0.38---7-----0.0244------80.810.970.920.820.870.8745-0.700.67-0.730.7390.600.610.750.620.730.57460.020.020.020.030.030.03100.170.170.170.200.200.1947------11-----0.0548------12-----0.68490.380.360.360.380.370.3713------501.421.781.811.421.341.43140.120.110.170.140.190.15510.410.410.420.430.430.4815-0.060.06-0.070.08520.710.710.640.690.710.70160.870.990.971.081.221.08530.790.571.130.710.771.00172.783.405.735.335.444.40540.120.100.100.090.090.08180.050.080.080.070.070.05550.200.180.250.190.190.16190.410.420.570.490.520.43256------200.230.280.370.430.420.43577.137.146.777.267.547.25211.881.871.862.012.032.00580.370.290.280.260.300.35220.010.020.030.030.030.03592.152.422.413.283.513.87230.981.450.940.780.960.8360-3.293.353.42--240.94-1.461.061.010.9661------25--0.170.180.190.20620.460.44----26------630.280.310.3040.260.290.25270.23-0.560.360.300.31640.190.17-0.180.19-28-----0.01650.320.370.440.360.410.40290.710.920.510.440.520.43661.270.680.69-0.720.713077.5175.6572.3377.7379.8878.64670.560.560.530.590.610.6131-0.05--0.080.07681.431.241.391.821.651.65323.343.153.123.633.563.38690.820.770.750.790.810.7933------701.150.530.250.442.100.4834-0.22--0.35-7162.6463.1945.7037.6455.3029.8235-0.32--0.51-722.182.041.882.212.411.9836------736.156.347.486.376.469.093723.4022.37-23.2223.8824.65

A-F are different brands of cut tobacco. Nos. 1-73 are the same as in Table 1. -: not detected.

3 结论

本文建立了一种溶剂萃取直接进样-气相色谱-三重四极杆质谱同时测定卷烟烟丝中73种香气物质的分析方法。该方法操作简单、定量准确、灵敏度高,能够满足实际烟草样品中香气物质的检测要求。本文建立的分析方法可以更准确地了解烟丝中每一香气成分的变化,是一种有效的质量控制手段,同时也可为新产品的研发提供技术支撑。运用该方法可以对更多的香气物质进行分析检测,为香气物质的检测开拓平台。

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Simultaneous determination of 73 flavor components in cut tobacco by gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry

XU Yong, JIANG Ciqing, LI Chao, WU Yiqin, ZHANG Dan, ZOU Nan, ZHANG Chengming, QIN Yunhua, MIAO Mingming, JIANG Wei*

(ResearchandDevelopmentCenter,ChinaTobaccoYunnanIndustrialCo.Ltd.,Kunming650231,China)

A method for simultaneous determination of 73 flavor components in cut tobacco by gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) was developed. The samples were extracted with anhydrous ether, and the ether extracts were separated on a DB-5MS column (30 m×0.25 mm, 0.25 μm). The interference of complex matrix and peak overlapping of various flavor components were reduced by means of optimizing tandem mass spectrometry parameters. The extracts were analyzed by GC-MS/MS under multiple reaction monitoring (MRM) mode, and internal standard method was applied to quantify the 73 flavor components. The results showed that all the flavor components had good linearity in certain ranges with the correlation coefficients (r2) greater than 0.99. The recoveries of the 73 flavor components at low, middle and high levels ranged from 70.0% to 122.3% with the relative standard deviations (RSDs) of 1.6%-20.4%. The developed method is easy, accurate and sensitive, and it can be applied to the determination of the 73 flavor components in cut tobacco.

gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (GC-MS/MS); multipe reaction monitoring (MRM); cut tobacco; flavor components

10.3724/SP.J.1123.2016.10047

2016-10-24

国家自然科学基金(21365026);云南中烟工业有限责任公司2015年度科技项目(2015JC07).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 21365026); 2015 Annual Science and Technology Project of Yunnan Tobacco Industry Co., Ltd. (No. 2015JC07).

O658

A

1000-8713(2017)04-0445-08

* 通讯联系人.E-mail:44466@163.com.