郝慧霞，李桂梅，莎 娜

黑素瘤[1]（melanoma）是由黑素细胞异常过度增殖引发的肿瘤，多为恶性，称为恶性黑素瘤（malignant melanoma)，多发生于皮肤及皮肤-黏膜交界处、眼脉络膜和软脑膜。大部分转移性恶性黑素瘤对多种化疗药物抵抗[2]，因此，治疗恶性黑素瘤是亟待攻克的难题。黑素瘤在中国的发病率并不是很高，约占全部恶性肿瘤的1%[3]。研究表明[4]，从传统中药姜黄中提取的姜黄素，对黑素瘤、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌等恶性肿瘤有较好的疗效，且没有明显的不良反应。

姜黄素是从草本植物姜黄的根茎中提取出来的一种酚类色素，具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤等作用[5]，而热疗可以提高化疗药物的敏感性[6]。本研究诣从细胞水平上探讨姜黄素联合热疗对人恶性黑素瘤A375细胞毒性是否存在协同效应，为临床上姜黄素联合热疗治疗皮肤恶性黑素瘤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

人恶性黑素瘤细胞株A375（北京协和细胞资源中心），噻唑蓝（MTT）及姜黄素试剂（美国Sigma公司），DMEM（高糖）培养基（Thermo公司），胎牛血清（天津市灏洋生物制品科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取人恶性黑素瘤A375细胞，培养于含10%胎牛血清、青霉素和链霉素各100 μg/ml的DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度环境的培养箱中常规传代培养，待生长至对数生长期，用0.25%胰酶消化，机械吹打成细胞悬液，调细胞浓度为2×105/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔100 μl，在37 ℃、5%CO2孵箱中培养24 h待细胞贴壁后备用；调浓度为4×105/ml人恶性黑素瘤A375细胞接种于25 ml培养瓶，在37 ℃、5%CO2孵箱中培养24 h待细胞贴壁后备用。

1.2.2 试剂配置 取姜黄素0.1842 g，用100 μl 二甲基亚砜溶解后，再用无水乙醇定容至100 ml，此即为5×103μmol/L姜黄素母液。取5×103μmol/L姜黄素母液2 ml，用培养基定容至100 ml，此姜黄素浓度为100 μmol/L，0.22 μm滤器过滤，分装每管10 ml、-20℃避光冻存、备用。

1.2.3 细胞活性比较 取备用细胞板随机作为30 μmol/L姜黄素组、单纯热疗组（43℃恒温水浴箱60 min）、30 μmol/L姜黄素联合热疗组（加完姜黄素后，放到43℃恒温水浴箱60 min）和对照组（加相同剂量的培养液），各组移入37 ℃、5%CO2孵箱中继续培养24 h，收获细胞前4 h，每孔分别加入20 μl MTT，37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下再培养4 h，终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜振荡10 min，于波长570 nm处测定吸光度（A值）。细胞增殖抑制率[7]=（对照组A值-对照组A值）×100%/对照组A值。

1.2.4 剂量反应关系 取备用细胞板随机作为0、10、20、30、40、50 μmol/L的姜黄素联合热疗组，在37 ℃、5%CO2孵箱中继续培养24 h后，重复1.2.3实验步骤。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡（Annexin V-PI双染法）

取备用细胞瓶作对照组、30 μmol/L姜黄素联合热疗组、50 μmol/L姜黄素联合热疗组，在37℃、5%CO2孵箱中继续培养48 h后，收集细胞，调整细胞浓度1×106/ml，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，70%冷乙醇固定，上机前过40目网调细胞数1×106/ml，碘化丙啶(PI)染色，流式细胞仪检测，Cell Quest软件收集细胞，Modi fi t软件分析处理数据。

1.3 统计学方法

利用SPSS 22.0软件进行统计学分析，资料描述均采用x¯±s表示；多组均数的比较采用单因素方差分析；多组率的比较采用非参数H检验；剂量反应关系采用Spearman秩相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 基本情况

倒置显微镜下观察人恶性黑素瘤A375细胞（图1），镜下可见其贴壁生长，呈梭形或不规则多角形，形态饱满，中央有核，核较圆。常规胰酶消化后，细胞逐渐变圆。随着姜黄素浓度的升高，细胞变圆脱壁，坏死、漂浮细胞增多，经Giemsa染色，随着姜黄素浓度的升高，显微镜下可见大量A375细胞核固缩、细胞核边缘化、核膜裂解、出现无核细胞、空泡细胞（图2-图4）。

图1 正常A375细胞对照组（×10倍）

图2 30 μmol/L姜黄素+热疗（×10倍）

图3 30 μmol/L姜黄素+热疗（Giemsa染色×100倍）

图4 50 μmol/L姜黄素+热疗（Giemsa染色×100倍）

2.2 细胞活性比较

与对照组相比，30 μmol/L姜黄素组、单纯热疗组、联合组的细胞活性均有不同程度的抑制，以联合组的细胞抑制率最高（45.95%），差异具有统计学意义（F=5.47，P＜0.01）。联合组的细胞抑制率显著高于30 μmol/L姜黄素组和热疗组（P＜0.01），30 μmol/L姜黄素组细胞抑制率高于热疗组11.71%，且差异有统计学意义（P＜0.01）（表1）。

表1 不同处理因素对A375细胞增殖活性的影响

2.3 剂量反应关系

A375细胞经10、20、30、40、50 μmol/L的姜黄素联合热疗处理后，随着姜黄素浓度的增加，A375细胞增殖抑制率也增加，并呈剂量依赖性，姜黄素浓度与A375细胞增殖抑制率存在正相关（rs=0.95）（表2）。

表2 不同浓度姜黄素联合热疗抑制A375细胞增殖剂量反应关系

2.4 流式细胞仪检测结果

不同处理因素诱导 A375细胞凋亡的毒性效应经流式细胞仪检测，与对照组相比，各处理因素组细胞早期凋亡率均增加。对照组、30 μmol/L姜黄素组、热疗组、30 μmol/L 姜黄素联合热疗组细胞早期凋亡率分别为4.27%、22.01%、17.14%和31.56%，差异具有统计学意义（H=15.37、P＜0.01）。

3 讨论

黑素瘤是一种源于皮肤正常黑素细胞的高度恶性肿瘤，发展迅速，恶性程度高，预后较差，病死率高[8,9]，其易复发和转移，预后较差，发生远处转移的5年生存率低于5%。

姜黄素[5,9]（C21H20O6，分子量368.37）是从姜黄属植物如姜黄、莪术等的根或茎中提取的一种有效成分，中医认为有理气、清热和散结的功效，盛产于东南亚地区和澳大利亚及我国南部。热疗是一种治疗恶性肿瘤有效的辅助方法，其基本原理是利用物理方法将肿瘤区域或全身组织加热到42.5～43.5 ℃，并维持一定时间，达到能破坏肿瘤细胞又不损伤正常组织的目的。目前热疗已被认为继手术治疗、放疗、化疗和生物免疫治疗后出现的治疗肿瘤有效方法[10]，成为肿瘤综合治疗有效的手段之一，同时因热疗不会对环境产生任何不良影响，因此被称为“绿色治疗”。

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本次研究结果显示，与对照组相比，30 μmol/L姜黄素组、单纯热疗组、30 μmol/L姜黄素联合热疗组的细胞活性均有不同程度的抑制，但以联合组的细胞抑制率最高，且差异具有统计学意义（P＜0.01)。说明姜黄素联合热疗有明显抑制A375细胞生长、增殖的作用，这与文献报告基本一致。邱实和谭升顺[11]研究显示，姜黄素能抑制人恶性黑素瘤A375细胞的增殖活性，其对人恶性黑素瘤A375细胞的毒性与姜黄素浓度成正相关关系和明显剂量-效应关系。Weber等[12]研究认为姜黄素可以靶向性地抑制转录因子NF-kB的诱导活化作用，阻碍细胞株抗凋亡机制的运行，促使癌细胞凋亡。也有研究认为[13]姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡是通过下调Bcl-2[14]及p53的表达，从而控制细胞凋亡。A375细胞增殖抑制率与姜黄素浓度存在正相关关系（rs=0.95），A375细胞增殖抑制率呈剂量依赖性，说明姜黄素联合热疗对恶性黑素瘤A375细胞的增殖抑制作用为协同相加作用，而不是拮抗作用。经流式细胞仪分析，不同处理因素诱导A375细胞凋亡的毒性效应，一方面显示30 μmol/L姜黄素联合热疗组细胞早期凋亡率分别高于30 μmol/L姜黄素组和热疗组9.6%和14.42%，这说明热疗具有增敏姜黄素的细胞毒性作用，姜黄素联合热疗对肿瘤细胞的毒性高于单纯姜黄素和热疗作用[15]。热疗对肿瘤细胞毒性机制较复杂，目前认为热疗一方面增强自然杀伤细胞活性，促进白细胞介素2和肿瘤坏死因子的生成，提高机体免疫功能，促进肿瘤细胞消除，另一方面刺激机体高表达热休克蛋白，它可参与特异性抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤生长和诱导肿瘤细胞凋亡[16]。

本次研究发现，姜黄素联合热疗对人恶性黑素瘤A375细胞的毒性起协同相加作用，热疗可加强姜黄素抑制A375细胞增殖的作用、提高姜黄素诱导A375细胞凋亡的敏感性和增敏姜黄素的细胞毒性。但细胞实验外用于临床治疗，还需要进一步的探索和研究。

【参 考 文 献】

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