陈进斌+兰书焕+李旭东

摘要 从畜禽养殖场、堆肥场、鱼塘等场所分离筛选除臭功能菌，获得6株具有显著除臭作用的微生物，分别为酵母菌Y-1、霉菌M-1、乳酸菌L-1、芽孢杆菌B-1和B-2、光合菌P-1。采用正交试验对功能菌进行优化组合，研制除臭复合菌剂。结果表明：Y-1、M-1、L-1、B-1、B-2、P-1的最优比例为1∶1∶1∶1∶3∶3，其对综合恶臭、TVOC、NH3和H2S的平均去除率分别为54.97%、18.66%、13.12%、41.18%，对综合恶臭、TVOC、NH3和H2S的最大去除率分别为72.95%、35.26%、20.20%、81.28%。复合菌剂能够明显减少猪粪中恶臭的产生量。

关键词 猪粪；生物除臭；综合恶臭；菌剂

中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）23-0172-03

Abstract Six microorganisms with high deodorization efficiency were isolated from livestock farm，compost site and fish pond，which were identified as yeast Y-1，mould M-1，lactobacillus L-1，bacillus B-1 and B-2 and photosynthetic bacteria P-1，respectively.The six strains were made into complex microbial agent，the combination ratio was optimized by orthogonal array design.The results showed that the optimal ratio of Y-1，M-1，L-1，B-1，B-2 and P-1 was 1∶1∶1∶1∶3∶3.In the deodorization of swine manure，the average reduction rate on odor intensity，TVOC，NH3 and H2S was 54.97%，18.66%，13.12%，41.18%，respectively，and the maximum reduction rate of that was 72.95%，35.26%，20.20%，81.28%，respectively.In conclusion，addition of microbial agent can significantly reduce the odor pollutants produced by swine manure.

Key words swine manure；biological deodorization；odor intensity；microbial agent

改革開放以来，我国畜禽养殖业得到了大发展，曾创造了20年连增的奇迹，年均增幅逾10%。然而，畜禽养殖业带来的环境污染对生态环境的影响也日趋严重[1-2]。其中，畜禽粪便产生的恶臭污染也是重要的环境污染之一。畜禽粪便中含有氨、硫化氢等有害气体，若未能及时清除或处理，将产生甲基硫醇、二甲二硫醚、甲硫醚及多种低级脂肪酸等恶臭气体，导致臭味成倍增加。这不仅影响了养殖场内畜禽的生长，而且也会对周围居民的身体健康产生威胁[3]。因此，开展除臭研究对畜禽粪便恶臭污染控制和管理具有重要意义[4]。

当前，在畜禽养殖除臭中，生物除臭是研究热点，国内外对生物除臭的研究多集中在生物滤池或生物滴滤塔除臭，如刘春敬通过构建高效生物除臭滴滤塔将臭味去除，其对H2S的去除率达90%[5]。由于这种除臭技术成本相对较高，在养殖场局部场所如堆肥场可采用，但对于受粪污污染的圈舍等场所因其面积大而难以大规模应用。因此，采用复合菌剂原位除臭是研究重点，目前应用最为广泛的除臭菌剂是日本EM（有效微生物）菌剂，其利用光合菌类、乳酸菌类、酵母菌类、丝状菌类和革兰氏阳性菌类等菌株来抑制恶臭物质的产生或分解恶臭物质，达到除臭效果[6]。但由于EM菌的广谱性，其在畜禽粪便除臭中的应用效果并不是十分理想。因此，研制对养殖场圈舍面源恶臭污染有针对性的复合菌剂尤为重要。本文则以养猪场圈舍面源恶臭污染治理为切入点，筛选出几株具有显著除臭作用的微生物，按照其功能及微生物之间的协同作用进行组合，研制高效除臭菌剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株。在畜禽养殖场、堆肥场、鱼塘等场所采样，实验室分离筛选到酵母菌、霉菌、乳酸菌、芽孢杆菌和光合菌。

1.1.2 粪样。试验所用粪样为取自四川省双流县富源养殖场的新鲜猪粪。

1.1.3 分离培养基。酵母菌：YPD培养基。霉菌：加入20～30 mg/L链霉素的PDA培养基。乳酸菌：MRS培养基。芽孢杆菌：牛肉膏蛋白胨培养基。光合菌：①富集培养基。通威光合菌分离用培养基10 g，水1 000 mL，pH值7.4～7.8；②双层培养基下层。通威光合菌分离用培养基10 g，琼脂10 g，水1 000 mL，pH值7.4～7.8；③双层培养基上层。通威光合菌分离用培养基10 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH值7.4～7.8[7]。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离。①酵母菌、霉菌、芽孢杆菌的分离。称取适量猪粪，制成菌悬液，分别加入酵母菌、霉菌、芽孢杆菌的液体培养基，30 ℃、160 r/min下富集培养。将富集后的菌液采用稀释涂布法分离，划线纯化，最后挑取单菌落至斜面保存备用。②乳酸菌的分离。称取适量猪粪，制成菌悬液，加入乳酸菌的液体分离培养基，30 ℃下静置富集培养。将富集后的菌液稀释涂布法分离，划线纯化，采用厌氧盒厌氧培养，最后挑取单菌落至斜面保存备用。③光合菌的分离。取10 g鱼塘的污泥加入250 mL无菌锥形瓶中，注满培养基，密封瓶口，置于30 ℃、白炽灯光照下厌氧富集培养。待液体培养物呈现红色或红褐色时转移至新培养基，2～3次重复。将富集后的菌液梯度稀释，取0.1 mL 10-2、10-3、10-4 3个稀释度的菌液与冷却至40～50 ℃的双层培养基下层相混合注入平皿，待下层培养基凝固后注入上层培养基[7]。采用双层平板法多次分离得到纯菌落后，接种于含液体培养基的厌氧瓶中培养，保种备用。

1.2.2 菌株的筛选。将筛选出的菌株液体培养至稳定期后，取菌液稀释10倍后按照10%接种量接入新鲜猪粪中，每天用感官法初步判定微生物的除臭效果，重复几次，筛选出具有除臭作用的微生物。

1.2.3 菌株的鉴定。试剂盒提取菌株的基因组DNA（酵母菌为26S D1/D2区，真菌为18S rDNA，细菌为16S rDNA），进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳确认，PCR产物送至上海生工生物有限公司测序[8]。

1.2.4 功能菌组合比例优化。选择Y-1、M-1、L-1、B-1、B-2、P-1 6株菌做正交试验，采用L27（313）正交表，以Y-1、M-1、L-1、B-1、B-2、P-1作为A、B、C、D、E、F 6个考察因素，选取3个添加量水平进行配制菌剂，取5 mL稀释10倍后的混合菌剂用于除臭试验，以5 d后装置内的综合恶臭浓度为指标考察效果（表1）。

1.2.5 菌剂除臭试验。模拟圈舍面源污染，将100 g新鲜猪粪置于5 L的除臭装置中（图1），猪粪的厚度约为0.5 cm，加入5 mL稀释10倍后的混合菌剂并搅拌均匀，将装置密封，以200 mL/min的速度向装置内通空气使装置内保持好氧环境，装置后面连接2个吸收瓶。一级吸收瓶中装有0.01 mol/L HCl溶液50 mL，用以吸收除臭装置中产生的NH3和H2S，二级吸收瓶中装有50 mL乙酸锌-乙酸钠溶液，用以吸收除臭装置中产生的H2S。将除臭装置置于30 ℃恒温培养箱中培养，每天测定装置内的综合恶臭、TVOC浓度和吸收瓶中的NH3和H2S含量。

1.2.6 综合恶臭、TVOC、NH3和H2S的测定。综合恶臭的测定：参照《空气质量恶臭的测定三点比较式臭袋法》（GB/T 14675—93）[9]；TVOC的测定：SLC-OP020手提式恶臭检测仪，韩国科学技术分析中心[10]；NH3的测定：参照《水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法》（HJ 535—2009）[11]；H2S的测定：参照《水质硫化物的测定亚甲基蓝分光光度法》（GB/T 1 6489—1996）[12]。

1.2.7 去除率的计算。计算公式具体如下：

2 结果与分析

2.1 除臭菌株的分离鉴定

从畜禽养殖场、堆肥场、鱼塘等场所共分离筛选到6株具有显著除臭作用的微生物，经26S rDNA D1/D2区序列分析，Y-1为罗伦隐球酵母菌（Cryptococcus laurentii）；經16S rDNA序列分析，B-1和B-2分别为Bacillus safensis和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），L-1为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum），P-1为沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）；经18S rDNA序列分析，M-1为卷枝毛霉（Mucor circinelloides）。

2.2 功能菌组配比例优化

按照表1的正交因素水平设计L27（313）正交试验，结果如表2所示。

由表2的极差分析结果可以看出，RE>RD>RA>RC>RF>RB，6株菌对综合恶臭去除的影响大小依次为B-2（E）>B-1（D）>Y-1（A）>L-1（C）>P-1（F）>M-1（B）。在试验设计范围内，优化得到除臭菌剂的最佳配方为E3D1A1C1F3B1，与直接观察法得到的结果相同。因此，Y-1、M-1、L-1、B-1、B-2、P-1的添加比例为1∶1∶1∶1∶3∶3时菌剂的除臭效果最好。

2.3 综合恶臭的去除效果

如图2所示，由于猪粪中的营养物质逐渐被消耗，对照组和试验组的综合恶臭浓度均随时间的增加而逐渐降低。综合恶臭的平均去除率为54.97%，去除率在第3天达到最大，为72.95%。

2.4 TVOC的去除效果

如图3所示，由于TVOC的成分比较复杂，因此TVOC随时间的变化没有明显规律。TVOC的平均去除率为18.66%，去除率在第3天达到最大，为35.26%。

2.5 NH3的去除效果

如图4所示，试验初期1～4 d，有机物质在微生物的作用下快速分解，氨气的释放量迅速升高，在第4天氨气的释放达到最高峰，然后氨气释放量迅速下降并趋于平稳。试验组的NH3释放量低于对照组，其主要原因是加入的除臭微生物控制了铵盐的分解，以及铵态氮被除臭微生物转化为其他形式的氮而被固定下来。NH3的平均去除率为13.12%，去除率在第5天达到最大，为20.20%。

2.6 H2S的去除效果

如图5所示，试验初期有机物质在微生物的作用下快速分解，H2S的释放量迅速升高，对照组的H2S释放量在第4天达到最高峰，试验组的H2S释放量在第5天达到最高峰，随着有机物质的消耗殆尽，H2S释放量迅速下降。菌剂对H2S有明显的去除效果，H2S的平均去除率为41.18%，去除率在第4天达到最大，为 81.28%。

2.7 复合菌剂除臭机理探讨

相关文献表明，复合菌剂原位除臭是一种基于微生物协同作用的多种菌群参与的除臭过程。酵母菌不仅可以分泌生理活性物质，还可以给其他有益微生物如乳酸菌等增殖所需要的基质提供重要的给养保障，促进有益微生物的快速生长，使其成为优势菌种，从而抑制产臭微生物的生长，减少恶臭气体的释放；而且酵母菌本身还可以产生一定量的香味，可以对粪便产生的恶臭气体起到掩盖作用[13]。霉菌能够将猪粪中不易降解的淀粉分解为小分子物质，从而为其他除臭菌提供营养物质。乳酸菌能够摄取光合菌、酵母菌产生的糖类形成乳酸，乳酸具有很强的杀菌能力，能够抑制猪粪中产臭微生物的活动和有机物的急剧腐败分解；而且乳酸菌能够分解猪粪中在常态下不易分解的木质素和纤维素，并使有机物发酵分解。芽孢杆菌不仅具有分解作用，而且也能抑制NH3的产生。朱珊珊通过将枯草芽孢杆菌用于发酵床生物除臭发现枯草芽孢杆菌能够抑制猪粪中NH3的产生[14]。光合菌能够以猪粪中的有机物及有害气体如H2S、NH3等为基质，合成糖类、氨基酸类、维生素类、氮素化合物和生理活性物质等，光合菌的代谢物质可以成为其他微生物繁殖的养分，光合菌如果增殖，其他的有益微生物也会增殖。王艳朋通过研究发现，沼泽红假单胞菌在厌氧条件下能够降解芳香烃累物质和3-氯苯酚等TVOC，而且光合菌在光照条件下能够利用硫化氢等还原剂，经细菌型光合作用将二氧化碳还原成为有机营养物[15]。Sawada通过试验也发现光合菌能够将硫化物转化为单质硫[16]。本研究研制的复合菌剂中有酵母菌、芽孢杆菌、霉菌、乳酸菌及光合菌，属于当前生物除臭复合菌剂中的主流菌群，与EM菌中的功能菌类似，据此推测，复合菌中各种菌能发挥其功能并具有一定的协同作用，进而取得良好的除臭效果。

3 结论与讨论

（1）本研究中分离到6株具有除臭作用的微生物，为酵母菌1株、霉菌1株、乳酸菌1株、芽孢杆菌2株、光合菌1株。

（2）通过正交试验确定除臭菌剂中Y-1、M-1、L-1、B-1、B-2、P-1的最适比例为1∶1∶1∶1∶3∶3。

（3）将菌剂应用于粪便除臭试验，菌剂对综合恶臭、TVOC、NH3和H2S的平均去除率分别为54.97%、18.66%、13.12%、41.18%，对综合恶臭、TVOC、NH3和H2S的最大去除率分别为72.95%、35.26%、20.20%、81.28%。

4 参考文献

[1] 顾文杰.禽粪好氧堆肥除臭菌筛选及其促腐熟效果研究[D].哈尔滨：东北农业大学，2008.

[2] 冯健，方新，于淼.生物除臭剂在畜禽粪便除臭中的应用实验[J].现代农业科技，2009（20）：286-288.

[3] ZHU Jun.A review of microbiology in swine manure ordor control[J].Agriculture，Ecosystems and Environment，2000（78）：93-106.

[4] YE Fenxia X，ZHU Ruifen，LI Ying.Deodorization of swine manure slurry using horseradish peroxidase and peroxides[J].Journal of Hazardous Mat-erials，2009，167（1/2/3）：138-153.

[5] 劉春敬.高效生物除臭滴滤塔的构建及微生态学分析[D].北京：北京工业大学，2012.

[6] 杨柳，邱艳君.畜禽养殖场恶臭气体的生物控制研究[J].中国沼气，2013，31（2）：30-33.

[7] 顾继锐，苏艳秋，伍翠芳，等.一株嗜盐光合菌的分离及对养殖污水的处理效果[J].淡水渔业，2011，41（5）：45-51.

[8] 刘爱华，王茜，袁丽杰，等.苯酚降解红球菌的分离鉴定及其降解特性研究[J].环境科学与技术，2013，36（6）：1-5.

[9] 空气质量恶臭的测定三点比较式臭袋法：GB/T 14675-93[S].北京：中国标准出版社，1993.

[10] YAN Zhiying，LIU Xiaofeng，YUAN Yuexiang，et al.Deodorization Study of the Swine Manure with Two Yeast Strains[J].Biotechnology and Biop-rocess Engineering，2013（18）：135-143.

[11] 水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法：HJ 535-2009[S].北京：中国环境科学出版社，2009.

[12] 水质硫化物的测定亚甲基蓝分光光度法：GB/T 16489-1996[S].北京：中国环境科学出版社，1996.

[13] 刘胜洪，程驹，郭长江，等.微生物除臭菌对改善畜禽养殖场环境的应用初探[J].天津农业科学，2011，17（4）：25-27.

[14] 朱珊珊.发酵床功能芽孢杆菌菌株的筛选及应用效果[D].保定：河北农业大学，2012.

[15] 王艳朋.光合菌在处理高浓度硫酸盐和高浓度有机废水中的应用[D].南京：南京大学，2011.

[16] SAWADA H.Photosynthetic bacteria in water treatment[J].Journal Fer-ment Technol，1997，55：311-316.