牟慧芳+齐雯雯+刘艳玲

摘要 在自然界中植物会不断遭受各种病原微生物的侵袭，严重影响植物的生长与作物的产量。经过长期互作影响，植物进化出复杂的抵御病原微生物的机制。microRNAs（miRNAs）作为一类长度在21～24nt、内源、非编码小RNA，能通过降解靶基因的mRNA或者抑制其翻译在转录后水平调节靶基因，进而参与植物的生长发育、非生物胁迫等众多生物过程。近年的研究显示，miRNA在植物抵御病原微生物的过程中扮演重要角色。本文从植物抵御细菌、病毒、真菌等方面综述了近年来miRNA参与的植物抵御病原微生物的研究进展，为揭示植物抵御生物胁迫机制提供理论基础。

关键词 miRNA；调控；植物；病原微生物；靶基因

中图分类号 Q943.2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）23-0144-04

Abstract Pathogenic microorganisms affect plant growth and cause great loss to crop yield.Plants evolved many biochemical and molecular mechanisms for resistance to pathogens.MicroRNAs（miRNAs），a small non-coding RNA with 21～24nt length，can regulate the targets expression by cleaving target mRNA or repressing translation atthe post-transcriptional levels.miRNAs involved in many biological processes，such as plant growth and development and abiotic stress responses.Over the past years，miRNAs have been validated to play crucial roles in biotic stresses.In this review，we summarized recent research progress in plant resistance to pathogens，which provided a useful resource for further understanding of miRNA functions in biotic stress.

Key words miRNA；regulation；plant；pathogenic microorganisms；target

植物在自然界的生长过程中会不断遭受各种病害的侵袭，对植物生长、农作物产量以及农产品品质均具有重要影响。一方面可造成农作物的严重减产，另一方面病害会对农产品的贮藏和加工过程带来巨大危害，造成农产品无法食用，甚至会引起食用后中毒。因此，揭示植物抵御病原微生物的机制，对植物病害的防治工作具有重要的意义[1]。

MicroRNAs（miRNAs）是广泛存在于动植物体以及微生物体内的一类长度为21～24nt的内源性非编码小RNA。miRNA通过切割靶mRNA或者抑制靶mRNA的翻译在转录后水平调节基因表达[2]。植物miRNA在生长发育的多个层面上扮演着重要的角色，如叶及繁殖器官的形态建成与分化、激素信号传导应答途径、营养代谢等[3]。此外，miRNA还在响应冷胁迫、盐胁迫、机械损伤等非生物胁迫中具有重要作用[3-4]。近年来，研究发现miRNA在植物抵御病原微生物侵染的过程中起重要作用。本文综述了近年来miRNA在植物病害中的研究进展，为miRNA调控的植物抵御病原微生物过程的研究提供了理论依据。

1 miRNA与细菌侵染

常见的植物细菌性病害包括水稻白叶枯病、作物青枯病、白菜软腐病、柑桔溃疡病等，每年都会影响农作物的生长和产量，造成巨大损失。近年来，许多研究显示miRNA参与了细菌侵染的植物过程，并且miRNA对这一过程的调节与激素有关。miR393是最早被报道的参与植物病原相关分子模式触发的免疫反应（PTI，PAMP-triggered immunity）的 miRNA，研究表明miR393能负向调控生长素信号，在植物抵御细菌侵染的过程中具有重要作用[5]。miR393可被细菌鞭毛蛋白N端的缩氨酸肽段（flg22）诱导表达，并通过靶向植物生长素受体基因TIR1（transport inhibitor response 1）、AFB2（auxin sign-aling F-box protein 2）和AFB3负向调节生长素信号。miR393在响应细菌的过程中具有很强的特异性，AFB1是TIR1的同源基因，由于存在与miR393靶位点的错配而不能被 miR393靶向。在突变体tir1中，AFB1受到丁香假单胞番茄致病变种（Pst DC3000）侵染的诱导，但在野生型拟南芥中，虽然 miR393 被Pst DC3000诱导表达量上调，但AFB1的表达水平未受到影响[5]。用细菌侵染野生型植株和miR393过表达植株后发现，miR393过表达植株中细菌效价比野生型植株低5倍，表明过表达miR393增加了植物的抗菌性[5]。后来的深度测序结果也验证了miR393在植物抗菌方面的作用，拟南芥叶片被无毒性的Pst DC3000（hrcC-）侵染后3 h，miR393的表达水平约为未处理组的10倍左右[6]。

此外，miR393还参与细菌防御途径中由效应因子引起的ETI（effector-triggered immunity）免疫反应。效应子是病原菌利用Ⅲ型分泌系統（Type Ⅲ Secreton System，TTSS）输送至宿主细胞的一类蛋白质[7]。PST Ⅲ型效应子AvrPtoB、AvrPto 和HopT1抑制宿主细胞中的RNA沉默，从而增加植物对细菌的易感性。在拟南芥中，这3个因子分别在miR393合成过程的不同阶段起重要作用。AvrPtoB能抑制miRNA基因的转录，导致pri-miR393的低表达；AvrPto抑制miRNA成熟体的形成以及miRNA的运输过程，导致miR393的表达量下降；HopT1抑制沉默复合体中AGO1的活性，影响miRNA的功能[8]。细菌在侵染植株的过程中对植物中 miRNA的合成产生影响，从而影响植物体内的RNA沉默。

miR393在根瘤农杆菌与植物的互作中也发挥重要作用，研究显示其根瘤的生长可能与生长素信号途径有关。不具有致瘤能力的农杆菌株感染烟草不会造成miR393的表达量发生改变，而可致瘤的农杆菌株感染烟草可诱导 miR393下调表达。研究表明，miR393能抑制生长素信号途径，抑制生长素信号途径会促进肿瘤的增长[9-10]。在农杆菌侵染烟草过程中，可通过下调miR393促进生长素信号途径抑制农杆菌根瘤的生长。

除了miR393，拟南芥miR160和miR167靶向植物生长素响应因子（ARF）基因家族在无毒性的Pst DC3000（hrcC-）侵染3 h后表达量上调[7]。在Candidatus Phytoplasma aurant-ifolia侵染墨西哥柠檬树后，检测到miR159、miR160、miR166、miR167、miR393在细菌侵染后表达水平有明显变化，它们的靶基因（ARF和MYB）在植物激素途径中起重要作用[11]。此外，在细菌侵染的墨西哥柠檬树中检测到了较高水平的IAA，也从一个侧面说明了生长素信号途径与植株对细菌的敏感性方面有重要的关系[11]。

植物miRNA响应细菌侵染的过程，除了与植物激素调节途径有密切联系，还与植物的活性氧途径有关。细菌侵染会使植物开启活性氧途径，增加活性氧（ROS）积累[12]。CSD是植物抵御活性氧毒害的主要超氧化物歧化酶，其中Cu/Zn超氧化物歧化酶基因（CSD1和CSD2）已经被验证为拟南芥miR398的靶基因[13-14]。为了研究miR398及其靶基因在植物抗菌方面的作用，分别用有毒性的Pst DC3000和无毒性的带效应子的Pst DC3000（avrRpt2）和Pst DC3000（avrRpm1）侵染拟南芥。miR398的表达量在Pst DC3000（avrRpt2）和 Pst DC3000（avrRpm1）侵染后都会有明显的下调，但Pst DC3000侵染后其表达量无明显变化。miR398的靶基因CSD1和 CSD2在细菌感染后具有不同的表达模式，在Pst DC3000（avrRpm1）侵染后，拟南芥中CSD1的表达量有明显的上调，但CSD2的表达量无明显的变化，说明植物的抗菌过程中存在依赖和不依赖miR398指导的不同的复杂机制[15]。

此外，研究也表明miRNA响应细菌感染的过程是一个复杂的过程，涉及到多个miRNA的共同响应，并调控多种生物学途径。拟南芥中，细菌鞭毛蛋白缩氨酸肽段flg22可以引起多种miRNA（miR156、miR160、miR167、miR169、miR391、miR396、miR398）及其靶基因的表达量变化，miRNA通过调控靶基因参与生长素信号途径、活性氧途径和DNA甲基化等多种生物学途径进行flg22的响应调控。此外，过表达 miR398和miR773的转基因植株对细菌感染更加敏感，细菌侵染后单位叶面积菌落数比野生型有明显的增加[16]。

近年有研究表明，miRNA*在响应细菌感染方面同样起重要作用。拟南芥中miRNA393*在抵御细菌感染的过程中发挥重要作用。在无毒性株系Pst DC3000（avrRpt2）和有毒性株系Pst DC3000（EV）侵染拟南芥后，ago2在6 h和14 h都有明显的上调，并且在接种细菌后，在ago2单突变和ago2/ago7双突变植株中，叶片单位面积菌落数都有明显的增加，而免疫共沉淀试验表明，miRNA393b*和ago2蛋白紧密结合。此外，在接种细菌后，过表达miRNA393b*的植株单位叶片面积菌落数比野生型有明显减少[17]。在Candidatus Phyto-plasma aurantifolia侵染墨西哥柠檬树后，检测到有许多miRNA*（miR160d*、miR157d*、miR156f*、miR169c*、miR15-7a*）表达量有明显变化[11]。

2 miRNA与真菌侵染

植物真菌性病害是危害植物的第一大类病害，占植物病害总数的80%，常见的四大病害（霜霉病、白粉病、锈病和黑粉病）都是由真菌引起的[18]。目前，有越来越多的证据显示miRNA在植物抗真菌过程中具有重要作用，并通过多种生物学途径共同发挥作用。

小麦白粉病是世界性病害，已成为影响小麦生产的主要病害之一[19]。Xin等[20]在2010年研究了小麦受到白粉病菌感染后miRNA的响应情况，这也是首次对小麦中miRNA在生物胁迫中的作用进行的研究。分别用白粉病菌侵染小麦敏感株系Jingdong8（JD8）和相近基因型的抗性株系Jingdong8-Pm30（JD8-Pm30），检测了这2个株系中miRNA在侵染前后表达量的变化。其中，有8个miRNA（miR393、miR444、miR827、miR2001、miR2005、miR2006、miR2011、miR2013）的表达量只在JD8株系中发生变化，有3个miRNA（miR171、miR2008、miR2012）的表达量只在JD8-Pm30株系中发生变化，有10个miRNA的表达量在JD8和JD8-Pm30株系中都发生变化，其中4个miRNA（miR156、miR159、miR164、miR396）在2个株系中都表现为表达下调。与植物激素信号途径密切相关的miR393在受白粉菌侵染的JD8-pm30植株中下调表达，表明由miRNA参与的植物激素调控在小麦抗白粉病中也起到重要作用[20]。

此外，灰霉菌（Botrytis cinerea）也是一种寄主范围广范的常见真菌，不仅能够危害田间作物，并且是引起窖藏性病害的主要真菌，嚴重危害窖藏的蔬菜水果[21]。Jin等利用miRNA芯片技术研究了番茄被灰霉菌（Botrytis cinerea）侵染后的miRNA表达量变化情况，结果显示sly-miR169的表达量在侵染后的5个时间点均上调，而sly-miR160和sly-miR171a的表达量只在处理1 d时下调。sly-miR169、sly-miR160和sly-miR171a的靶基因分别是转录因子NF-YA5、ARF17和SCL6。定量结果显示ARF17和SCL6在处理12 h表达量有明显上调，但在处理7 d时下调到未处理的水平，而NF-YA5在侵染后表达量明显下调[22]。

在木本植物毛果杨中，miRNA能够介导植株应答杨树溃疡病菌（Botryosphaeria dothidea）的侵染。运用基因芯片技术鉴定到在毛果杨被葡萄座腔菌感染后，有12个miRNA 家族的41个成员的表达量发生了变化。这些miRNA的靶基因有植物抗病蛋白（NBS-LRR proteins）、过氧化物酶、细胞分裂素氧化酶、MYB、ARF等，涉及多种生物学过程。分析了其中的CKX、CSD、POD等靶基因的表达量变化情况，显示其在真菌处理后均有不同程度的下调表达[23]。近期研究表明，在禾本科植物玉米中zma-miR393能响应纹枯病菌（R.Solani）感染，并通过下调其靶基因TIR1的表达量调节生长素信号途径，进而应答真菌感染[24]。小麦中tae-miR164在小麦条锈病侵染后表达量发生变化，其靶基因 TaNAC21/22转录因子在植株对条锈病的抵抗中起负调控作用[25]。

miRNA在植株系统防御中有重要的作用。梭型栎柱锈菌（Cronartium quercuum f.sp.Fusiforme）侵染火炬松会导致部分miRNA表达量发生变化。在火炬松发育中的木质部中，克隆得到4个保守miRNA家族和7个火炬松特有的miRNA家族中共26个miRNA。火炬松感染栎柱锈菌后会在松树茎部表现梭形瘿瘤，检测这11个miRNA家族中有10个家族中的miRNA在感染部位的茎中下调表达，而在根和感染部位上部的茎中无明显变化。虽感染部位上部的茎中 miRNA水平无明显变化，但这些miRNA的靶基因表达量有明显上升。表明在锈病菌感染后，火炬松可能会在未感染部分产生免疫反应，引发植物的系统防御，在病菌侵染前启动保护机制[26]。

3 miRNA与病毒侵染

植物一般通过小RNA介导的RNA沉默来抵御病毒入侵，而病毒也进化出沉默抑制子对抗寄主的RNA沉默[27]。目前已经鉴定到多种病毒沉默抑制子，最早被鉴定到的是烟草蚀纹病毒（TEV）的HcPro蛋白和黄瓜花叶病毒（CMV）的2b蛋白[28]。这些沉默抑制子通过作用于RNA沉默的不同阶段，从而干扰寄主的RNA沉默过程，影响寄主与RNA沉默相关的生物学途径[29-30]。

研究表明，多种植物miRNA在响应病毒感染的过程中受到病毒沉默抑制子的调控。miR168在烟草、拟南芥、苜蓿以及番茄中可响应多种病毒侵染，如番茄丛矮病毒（CymRSV）、长叶车前花叶病毒（RMV）、烟草蚀纹病毒（TEV）、菽麻花叶病毒（SHMV）等[31]。miR168靶向RNA诱导的沉默复合体（RISC）的核心蛋白AGO1基因，病毒沉默抑制子p19能诱导miR168上调表达，下调AGO1的mRNA，保持AGO1的蛋白水平[32]。黄瓜花叶病毒（CMV）侵染拟南芥后，拟南芥中miR162、miR164、miR165、miR167、miR168明显上调表达，同时AGO1的表达量也有明显的上调[33]。miR162和miR168的靶基因分别是编码miRNA合成的关键蛋白的DCL1基因和编码miRNA行使功能的核心蛋白AGO1基因，它们通过自身反馈调节对自身及整个miRNA系统进行表达及功能调控[31，34]。黄瓜花叶病毒的2b蛋白能促进miR162和miR168的表达，通过与DCL1和AGO1的复杂互作，最终抑制 miR162对DCL1的切割及miR168对AGO1的切割，使得AGO1上调表达，同时间接调控其他miRNA的功能，具有十分复杂的调控机制[33]。最近研究显示，黄瓜miR159和 miR858可响应黄瓜绿斑花叶病毒（Cuucmber green mottle mosaic，CGMMV）侵染，同时这种响应存在组织时空特异性，且变化显著[35]。利用 RNA-seq技术对水稻黑条埃索病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）侵染后的玉米进行转录组测序，鉴定出17个玉米miRNA家族中31个响应RBSDV的miRNA成员，并且表达量差异均在2倍以上[36]。其中 miR319、miR396、miR408、miR1432、miR4366、miR8155、miR9773和miR9774家族均上调表达；miR156、miR158、miR160、miR395和 miR8677家族下调表达；而miR166、miR167、miR169和miR399家族的不同成员呈现出不同的表达模式[37]。

植物miRNA响应病毒的过程中，除了受到病毒抑制子的调控，其响应过程还与抗病蛋白NBS-LRR有很大的关系。芜菁中bra-miR158和bra-miR1885在芜菁花叶病毒（TuMV）感染后上调表达，其对TuMV的感应具有特异性。在黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒以及真菌病原体核盘菌感染后，这2个miRNA的表达量均无明显变化。预测bra-miR1885的靶基因是抗病蛋白NBS-LRR家族中的一员[38]。此外，烟草中的nta-miR6019 和 nta-miR6020响应烟草花叶病毒感染。在烟草中过表达nta-miR6019 和 nta-miR6020，其靶基因NBS-LRR的表达受到抑制，并且过表达植株耐烟草花叶病毒的能力下降[39]。高通量测序结果显示，大豆在大豆花叶病毒侵染后，有10个miRNA响应病毒感染。其中miR160、miR393的靶基因包括ARF、AFB等参与植物激素信号途径，miR1510的靶基因glyma12g07680编码植物抗病蛋白NBS-LRR的同源蛋白[36]。番茄中miR482在蕪菁皱缩病毒TCV（Turnip crinkle virus）、黄瓜花叶病毒CMV（Cucu-mber mosaic virus）、烟草脆裂病毒TRV（Tobacco rattlevirus）侵染后表达量下调，其靶基因为NBS-LRR蛋白家族中的LRR1和LRR2，靶基因的表达量在侵染后表现出相应的上调。在这个调节过程中，miR482具有2种调控机制，一种为传统意义上的直接切割靶基因；另外一种则是切割后的靶基因形成许多次级siRNA，被称为phasiRNA，phasiRNA能对下游的靶基因进行切割，phasiRNA的部分靶基因为NBS-LRR类基因[40-41]。

還有一些响应病毒感染的miRNA作用机制现在还不明确。印度香米在被东格鲁病毒（rice tungro virus）侵染后，miR-41在被感染叶片和花中都有较高积累，在被感染花中miR-41表达量大概为未感染的3倍，miR-47在感染后的叶片中表达量约为未感染叶片表达量的6倍。但miR-41和miR-47的靶基因未被预测到，因此其作用机制还需研究[42]。

植物在受2个病毒共同感染时，miRNA具有更复杂的表达模式。在马铃薯X病毒PVX（Potato virus X）和马铃薯Y病毒PVY（Potato virus Y）分别和共同感染烟草的情况下miRNA的表达模式不同。miR156在PVX和PVY共同感染的情况下，表达量高于其单独感染。而miR171在感染第8天时，在PVX和PVY共同感染的情况下，表达量低于PVX和PVY单独感染，且与未感染植株中表达量相似。在感染第11天，miR171在PVX和PVY共同感染的情况下，表达量低于PVX和PVY单独感染，且表达量低于未感染植株[43]。这一现象在双生病毒侵染烟草的过程中也有报道。烟草中miR4376在TYLCCNV（Y10A）和TYLCCNB（Y10β）的共侵染后表达量明显低于在TYLCCNV（Y10A）单独侵染后的表达量[44]。

4 结语

植物miRNA在抵御病原微生物方面具有重要作用，其参与植物免疫中的PTI和ETI过程，对病毒抑制沉默子敏感，还在植物共生固氮中具有重要作用。从现有研究中可看出，植物激素信号途径在miRNA调节的植物抵御病原微生物过程中具有重要作用，在细菌、真菌、共生固氮菌、病毒与植物互作过程中都检测到了与植物激素信号途径相关的miRNA。此外，还检测到一些与其他生物学途径如氧化还原途径相关的miRNA对病原微生物的响应，表明 miRNA在植物抵御病原微生物过程中具有复杂的调控机制。但对于miRNA调控的病原微生物胁迫方面的研究，目前多集中于植物应答病原微生物miRNA及靶基因的差异表达分析，而对这些差异表达miRNA及其靶基因调控机制的深入研究相对较少。miRNA在生物体内有复杂的调控机制，逐一解析病原微生物应答的植物miRNA调控的代谢途径、信号途径及生理学适应将成为今后研究重点。透彻揭示miRNA在植物抵御病原微生物中的详细机制，是对植物抵御生物胁迫机制的有益补充，并可能为农业生产中的生物胁迫防治提供新思路。

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