APP下载

Exendin—4对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的抗氧化保护作用

2017-04-06张晨禹潘谢添胡健强王婷婷

中国医药导报 2017年4期
关键词:乳鼠复氧培养液

张晨禹++潘谢添++胡健强+王婷婷

[摘要] 目的 探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤中的抗氧化作用。 方法 取出生1~3d的SD大鼠乳鼠心脏,采用差速贴壁法分离并培养其心肌细胞,通过对乳鼠心肌细胞H/R损伤模拟缺血再灌注。实验共分为5组,A组:正常对照组;B组:H/R组;C组:缺氧预处理组,先缺氧20 min后复氧20 min,然后进行H/R;D组:GLP-1激动剂组,Exendin-4预处理之后进行H/R;E组:GLP-1拮抗剂组,Exendin-4+Exendin-(9-39)预处理之后进行H/R。各组于复氧后,使用MTT比色法检测各组细胞存活率;乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒检测各组细胞损伤程度。 结果 与A组相比较,B组心肌细胞存活率明显降低,培养液中LDH漏出量显著增加,细胞上清液中SOD活性明显降低且MDA含量明显增加,差异具有统计学意义(P < 0.01)。与B组相比较,C组和D组存活率明显增加,培养液中LDH漏出量显著减少,细胞中SOD活性明显升高且MDA含量明顯降低,差异具有统计学意义(P < 0.05),而二组之间差异无统计学意义(P > 0.05)。但给予GLP-1拮抗剂后显著降低其保护作用。 结论 Exendin-4通过GLP-1R依赖机制减少缺氧造成的氧化应激损伤,进而保护心肌细胞,表明GLP-1具有抗氧化保护作用。

[关键词] 胰高血糖素样肽-1;缺氧/复氧;氧化应激

[中图分类号] R363 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2017)02(a)-0012-04

Antioxidant protective effect of Exendin-4 on hypoxia / reoxygenation injury in cultured neonatal rat cardiomyocytes

ZHANG Chenyu PAN Xietian HU Jianqiang WANG Tingting GAO Haokao▲

Department of Cardiology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Shaanxi, Xi′an 710032, China

[Abstract] Objective To investigate antioxidant protective effect of glucagon like peptide -1 (GLP-1) on the hypoxia / reoxygenation (H/R) injury in neonatal rat cardiomyocytes. Methods The rat heart was isolated from 1 to 3 days old SD rats, and the cardiomyocytes were isolated and cultured by differential adherence method. The myocardial ischemia-reperfusion injury was simulated by H/R damage. The experiments were divided into 5 groups: group A: normal control group; group B: H/R group; group C: hypoxia preconditioning group, first hypoxia for 20min, and reoxygenation for 20min, then H/R; group D: GLP-1 agonist group, after Exendin-4 pretreatment, then H/R; group E: GLP-1 antagonist group, after Exendin-4 + Exendin- (9-39) pretreatment, then H/R. After reoxygenation, the cell survival rate of each group was detected by MTT colorimetric assay, and the cell damage degree of each group was detected by LDH, superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA). Results Compared with A group, myocardial cell survival rate in B group was significantly decreased, LDH in culture fluid leakage in the supernatant was significantly increased, SOD activity decreased and MDA content increased significantly, the difference was statistically significant (P < 0.01). Compared with B group, the survival rate of C group and D group was significantly increased, the LDH leakage in the culture medium significantly reduced, the activity of SOD in cells was significantly increased and the content of MDA was significantly reduced, the difference was statistically significant (P < 0.05), but there was no significant difference between the two groups (P > 0.05). However, the protective effect was significantly decreased after giving GLP-1 antagonist. Conclusion Exendin-4 can reduce the oxidative stress injury induced by hypoxia and protect the myocardial cells through GLP-1R dependent mechanism, which indicates that GLP-1 has the protective effect of antioxidation.

[Key words] Glucagon-like peptide-1; Hypoxia/reoxygenation; Oxidative stress

心肌缺血再灌注损伤是临床心肌梗死的研究热点之一,但其机制目前尚未完全阐明清除。心肌细胞的缺氧复氧(H/R)损伤是主要的病理基础。胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是由肠道内分泌细胞-L细胞分泌的一种肠降血糖素,能够刺激胰岛素分泌及抑制胰高血糖素分泌和胃排空[1]。因其受体(GLP-1R)分布十分广泛的特点决定了GLP-1长效激动剂Exentin-4具有复杂的生理功能,目前在临床上主要用于2型糖尿病的治疗。近年来有研究发现[2]Exentin-4具有潜在的心血管保护作用,对心肌梗死病人给予后可改善患者心功能,且在心肌缺血再灌注中可显著减少心肌梗死面积[3-4]。但目前国内关于Exendin-4对体外心肌细胞H/R損伤的研究相对较少。本实验拟通过制备乳鼠心肌细胞H/R损伤模型,研究GLP-1R激动剂Exendin-4及其拮抗剂Exendin-(9-39)对乳鼠心肌细胞的H/R损伤的影响,初步探讨作用机制,为临床心肌缺血再灌注的治疗提出新的线索。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物为新生1~2 d龄的SD大鼠,雌雄不限,由第四军医大学实验动物中心提供,合格证书:SCXK(军)2012-0007。DMEM培养基和新生胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司;Ι型胶原酶、Exentin-4、MTT均购自美国Sigma公司;Exendin(9-39)购自美国Anaspec公司。LDH活性检测试剂盒、SOD和MDA含量测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 乳鼠心肌细胞的培养

采用酶解法[5]分离乳鼠心肌细胞。无菌条件下取出生1~2 d的SD大鼠心脏,用预冷的PBS液洗涤心脏3遍后将其剪碎。加入1 g/L的Ι型胶原酶用滴管吹打消化5 min后收集上清液,重复消化5次。在收集每次消化后的上清液中加等量100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基用于中和消化酶。轻吹打混合液,过孔径200目的不锈钢网滤除未消化组织。将上述含细胞液的离心管以800 r/min离心5 min,弃上清,加入含20%胎牛血清的DMEM培养基重新悬浮细胞团,后放入CO2培养箱中孵育90 min后,培养液中未贴壁细胞即为心肌细胞。采用差速贴壁法制成浓度为1.5×108/mL细胞悬液接种于6孔培养板中,放入37℃、5% CO2孵箱中培养24 h后,48 h后更换培养液,以后隔日换液一次。

1.3 实验分组及H/R模型的建立

本实验采用状态良好的2~3代乳鼠心肌细胞进行研究。实验随机分为5组: A组:正常对照组,不进行缺氧处理;B组:H/R组;C组:缺氧预处理组,此组作为阳性对照组,使用缺氧孵育容器于H/R前进行缺氧预处理;D组:GLP-1激动剂组,参考文献[6-7]Exendin-4(10 nmol/L)预处理之后进行H/R;E组:GLP-1拮抗剂组,Exendin-4(10 nmol/L)+Exendin-(9-39)(100 nmol/L)预处理之后再进行H/R。每组设8个复孔。参照文献[8]报道方法制备H/R损伤乳鼠心肌细胞模型:将培养板置于持续95% N2+5% CO2平衡的缺氧孵育容器中2 h,造成乳鼠心肌细胞的缺氧;之后更换培养液并放置于95%O2+5%CO2培养箱中进行复氧1 h;C、D及E组于H/R前30 min进行预处理。

1.4 细胞存活率的测定

MTT比色法是检测细胞存活和生长的常用方法[9]。将心肌细胞用0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液,用DMEM培养液调整细胞浓度为5×104/mL,接种于96孔培养板,每孔约100 μL,在37℃,5%CO2条件下培养24 h后弃上清。按1.3所述进行分组,每组设8个复孔。H/R损伤后加入MTT容液(5 mg/mL)10 μL, 37℃孵育4 h后弃去上清液,每孔再加入200 μL DMSO终止反应,震荡15 min后用酶联免疫检测仪测定波长570 nm处测定吸光度A值,然后计算细胞存活率:细胞存活率(%)=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.5 培养液中LDH含量的检测

分别取各组心肌细胞培养液,按照试剂盒的操作方法步骤,采用全自动生化分析仪平行测定各组细胞培养液LDH含量。

1.6 细胞中SOD活性及MDA含量的检测

弃培养基取细胞,每孔加入2 mL PBS,通过超声波细胞破碎仪于10 kHz下冰浴中处理30 s,之后3500 r/min低温(4°C)半径10 cm离心10 min,留取上清液。按试剂盒的操作说明书要求,通过紫外-可见分光光度计平行测定各组细胞裂解液中SOD活性及MDA含量。

1.7 统计学分析

所有实验数据均运用SPSS16.0统计软件进行分析,实验数据以(x±s)的形式表示,组间均数比较采用单因素方差分析,P < 0.05表示差异具有统计学意义。P < 0.01表示差异具有高度统计学意义。

2 结果

2.1 Exendin-4对H/R损伤乳鼠心肌细胞存活率的影响

心肌细胞经H/R后发现心肌细胞存活率降低,较A组相比差异有统计学意义(P < 0.01);较B组相比,经Exendin-4预处理后乳鼠心肌细胞存活率升高19%,而给予GLP-1R拮抗后细胞存活率显著降低,差异有统计学意义(P < 0.05),取消了GLP-1对细胞保护作用。结果见图1。

2.2 Exendin-4对H/R损伤乳鼠心肌细胞培养液中LDH含量的影响

B组乳鼠心肌细胞培养液中LDH活性较A组升高0.47倍(P < 0.01);与B组相比较,经缺氧预处理和Exendin-4预处理之后,培养液中LDH含量显著降低(P < 0.05,P < 0.01),而与D组相比较,E组培养液LDH含量明显上升(P < 0.05)。结果见图2。

2.3 Exendin-4对H/R损伤乳鼠心肌细胞SOD活性的影响

与A组相比,B组心肌细胞中SOD活性降低2.3倍(P < 0.01);与B组相比较,经缺氧预处理或Exendin-4干预后乳鼠心肌细胞中SOD活性显著升高(P < 0.05,P < 0.01),而与D组相比较,E组SOD活性降低(P < 0.05),结果见图3。

2.4 Exendin-4对H/R损伤乳鼠心肌细胞MDA含量的影响

B组心肌细胞中MDA含量较A组明显升高,差异具有统计学意义(P < 0.01);与B组相比较,经缺氧预处理或Exendin-4干预后乳鼠心肌细胞中MDA含量明显降低(P < 0.05),而与D组相比较,E组MDA含量明显升高(P < 0.05),结果见图4。

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤是指在短时间内心肌血供中断而后恢复血液再灌注,心肌细胞H/R是其主要的病理基础[8]。但再灌注往往会加重心肌细胞的损伤。BoseAK[10]的研究表明,GLP-1受体激动剂能显著减轻心肌缺血再灌注损伤,有效改善心功能,其研究首次阐明了GLP-1在大鼠离体心脏中对抗心肌梗死的作用,提出GLP-1可能通过激活多种激酶发挥抗氧化作用,从而保护心肌细胞[11-12]。刘艳霞等[13-14]研究发现,心肌细胞复氧后大量的自由基生成而诱发氧化应激损伤在心肌细胞H/R损伤过程中发挥着重要作用。因此,在恢复血流再灌注的同时,减轻细胞氧化应激程度,将有效提升心肌梗死的治疗效果。

在心肌细胞缺血再灌注损伤发病过程中发挥着重要作用的是氧自由基大量生成,进而诱发氧化应激损伤[15]。在本实验中发现乳鼠心肌细胞H/R后LDH活性升高、SOD活性下降、MDA含量升高,表明乳鼠心肌细胞的损伤伴随着氧化应激。LDH作为糖酵解中重要的酶,可促进心肌细胞在缺氧状态下催化丙酮酸生成乳酸。当心肌细胞膜受损伤后,细胞中的心肌酶迅速释放,故LDH的含量水平可反映心肌细胞受损程度。SOD是一种重要的抗氧化酶,对细胞缺氧损伤时的氧化与抗氧化平衡起重要作用。其通过清除氧自由基保护细胞,故其活性高低可间接反映机体清除氧自由基的能力[16-17]。在心肌细胞缺氧损伤过程中,堆积的氧自由基可引起细胞膜损伤,发生脂质过氧化而生成丙二醛(MDA),故细胞培养液中MDA的含量高低又能间接反映心肌细胞氧化应激损伤程度[18]。本实验结果发现,GLP-1激动剂组能显著降低H/R损伤乳鼠心肌细胞培养液中LDH含量,并提高乳鼠心肌细胞中SOD活性,降低MDA含量,从而减轻心肌细胞H/R损伤。说明Exendin-4对缺氧心肌细胞具有保护作用,并且其效果明显优于缺氧预处理组,而GLP-1受体拮抗剂Exendin(9-39)取消了其对心肌H/R损伤的保护作用。在以往的大鼠心肌缺血再灌注在体模型中也得到证实[19-20],与本研究报道基本一致。

从实验到临床,科研工作者已经对GLP-1对抗心肌缺血再灌注损伤的作用做了大量研究。通过本研究证实Exendin-4可能通过保护细胞膜完整性,减轻脂質过氧化损伤,从而降低心肌细胞凋亡率。综上所述,本研究进一步证实了GLP-1R激动剂对心肌细胞缺氧损伤的保护作用,为心肌梗死提供了治疗靶点和潜在的治疗方法,也为GLP-1及其类似物的心血管保护作用提供理论依据。

[参考文献]

[1] Drucker DJ. The biology of incretin hormones [J]. Cell Metab,2006,3(3):153-165.

[2] Nikolaidis LA, Elahi D, Hentosz T, et al. Recombinant glucagon-like peptide-1 increases myocardial glucose uptake andimproves left ventricular performance in conscious dogs with pacing-induced dilated cardiomyopathy[J]. Circulation,2004,110(8):955-961.

[3] Sonne DP, Engstrom T,Treiman M. Protective effects of GLP-1 analogues exendin-4 and GLP-1(9-36) amide against ischemia-reperfusion injury in rat heart[J]. Regul Pept,2008,146(1-3):243-249.

[4] Kalpana Velmurugan, AN Balamurugan, Gopalakrishnan Loganathan. Antiapoptotic Action of Exendin-4 against hypoxia and Cytokines Are Augmented by CREB[J]. Endocrinology,2012,153(3):1116-1128.

[5] 李冬冬, 张海峰, 孙露,等.脂联素通过APPL1减轻缺氧/复氧损伤诱导的心肌细胞凋亡 [J]. 心脏杂志,2012, 24(3):287-291.

[6] 孔庆平, 孟丽, 江柳,等. Exendin-4对高糖诱导的心肌细胞氧化应激的影响 [J]. 武汉大学学报(医学版) ,2013, 34(4):520-523.

[7] 马世凤, 洪天配, 魏蕊,等.艾塞那肽对同型半胱氨酸诱导的人脐静脉内皮细胞氧化损伤的保护作用及其潜在机制[J]. 中国糖尿病杂志,2013,21(4):345-348.

[8] 高好考, 王海昌, 张荣庆,等. 一氧化氮对培养乳鼠心肌细胞低氧复氧损伤的影响[J]. 心脏杂志,2004,16(2):116-117,120.

[9] 刘琴, 李凌云, 乔世刚,等.七氟烷预处理对缺氧/复氧损伤的心肌细胞H9c2 LC3蛋白表达的影响[J]. 苏州大学学报(医学版) ,2011,31(1):39-42.

[10] Bose AK,Mocanu MM,Carr RD,et al. Glucagon-like peptide 1 can directly protect the heart against ischemia/reperfusion injury[J]. Diabetes,2005,54(1):146-151.

[11] 易湘,鲁艳菊,付娟,等.GLP-1抗心肌缺血再灌注损伤分子机制的研究进展[J]. 中国动脉硬化杂志,2015,23(5):532-535.

[12] KiwonBan, M.Hossein Noyan-Ashraf,Judith Hoefer. Cardioprotective and Vasodilatory Action of Glucagon-Like Peptide 1 Receptor Are Mediated Through Both Glucagon-Like Peptide 1 Receptor-Dependent and-Independent Pathways[J]. Circulation,2008,118(4):2340-2350.

[13] 刘艳霞, 顾云, 辛毅, 等. 大鼠急性心肌缺血再灌注损伤诱导细胞凋亡的实验研究[J]. 心肺血管病杂志,2009,28(3):191-194,217.

[14] 苏丽华,王璇琳,贺敏,等. 黑青稞籽皮提取物对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用 [J]. 中国医药导报,2014, 11(12):21-24,169.

[15] 王媛媛,曹建, 邓莉,等. 乌司他丁对大鼠缺血再灌注心肌細胞的保护机制[J].中国医药导报,2014,11(20):13-15.

[16] Zweier JL,Rayburn BK,Flaherty JT,et al. Recombinant superoxide dismutase reduces oxygen free radical concentrations in reperfused myocardium [J]. J Clin Invet,1987,80(6):1728-1734.

[17] 李洪哲,金香子. 黄芪对体外培养心肌细胞保护作用的实验研究[J].中国医药导报,2008,5(35):11-13.

[18] 侯志文,于波, 孟凡吉,等. 缺氧复氧对乳鼠心肌细胞的损伤的研究[J]. 中国医科大学学报,2012,41(2):120-123,127.

[19] 鲁佳佳,胡笑容,胡钢英,等. exendin-4预处理对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响 [J]. 疑难病杂志,2014, 13(7):717-720,771.

[20] Jiang.YQ,Chang GL,Wang Y,et al. Geniposide Prevents Hypoxia/Reoxygenation-Induced Apoptosis in H9c2 Cells: Improvement of Mitochondrial Dysfunction and Activation of GLP-1R and the PI3K/AKT Signaling Pathway[J]. Cell Physiol Biochem,2016,39(1):407-421.

(收稿日期:2016-11-30 本文编辑:占汇娟)

猜你喜欢

乳鼠复氧培养液
汉防己甲素对先天性巨结肠乳鼠炎症的改善作用及对JAK2/STAT3通路的影响
活血解毒方对缺氧/复氧所致心肌细胞凋亡的影响
从一道试题再说血细胞计数板的使用
改良无血清法培养新生SD乳鼠原代海马神经元细胞
调整蔗糖、硼酸和pH值可优化甜樱桃花粉萌发培养液
不同培养液对大草履虫生长与形态的影响研究
Wnt/β-catenin通路在肾衰康灌肠液抑制HK-2细胞缺氧/复氧损伤的作用
苦参素对缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞氧化应激和细胞凋亡的影响
灵芝多糖肽对培养乳大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用
超级培养液