卫美蓉，施喜侠，刘晶，王笑峰

(1西京学院，西安710123；2西安高新医院；3深圳市南山区第六人民医院；4青岛大学)

胃癌患者Toll样受体4基因rs10759932、rs11536889多态性观察

卫美蓉1，施喜侠2，刘晶3，王笑峰4

(1西京学院，西安710123；2西安高新医院；3深圳市南山区第六人民医院；4青岛大学)

目的观察胃癌及EB病毒(EBV)阳性胃癌患者Toll样受体4(TLR4)基因rs10759932、rs11536889多态性，探讨其与胃癌和EBV相关胃癌(EBVaGC)易感性的关系。方法采用PCR结合限制性片段长度多态性(RFLP)检测160例胃癌患者[胃癌组，包括41例EBVaGC患者和119例EBV阴性(EBVnGC)患者]、100例健康体检者(对照组)TLR4基因rs10759932、rs11536889位点多态性。结果①TLR4基因rs10759932位点多态性：胃癌组基因型TT者90例、TC者53例、CC者7例，等位基因T频数233(77.7%)、等位基因C频数67(22.3%)。对照组基因型TT者42例、TC者40例、CC者18例，等位基因T频数124(62.0%)、等位基因C频数76(38.0%)。胃癌组TT基因型频率明显高于对照组(χ2=14.373,P<0.01)。与携带CC基因型者相比，携带TT基因型者罹患胃癌的风险增加(OR=5.510,95%CI为2.138～14.202，P<0.01)。胃癌组和对照组等位基因T、C频率比较有统计学差异(χ2=14.423，P<0.01)。个体携带等位基因C可以降低罹患胃癌的风险(OR=2.131,95%CI为1.437～3.161,P<0.01)。胃癌组EBVaGC和EBVnGC患者基因型和等位基因分布相比，P均>0.05。②TLR4基因rs11536889位点多态性：胃癌组和对照组、胃癌组EBVaGC和EBVnGC患者基因型和等位基因分布相比，P均>0.05。结论TLR4基因rs10759932位点多态性与胃癌易感性有关，携带C等位基因者罹患胃癌的风险较低。TLR4基因rs11536889位点多态性与胃癌易感性无关。TLR4基因rs10759932、rs11536889位点多态性与胃癌是否合并EBV感染无关。

胃癌；EB病毒；Toll样受体4；单核苷酸多态性

胃癌的发病过程极其复杂，是多步骤、多因素参与形成的。一方面是因为机体DNA长期暴露于不利的环境中导致DNA损伤，从而引发癌基因激活和(或)抑癌基因失活，最终促使肿瘤的形成[1]；另一方面原因为基因存在多态性，使得部分个体由于携带肿瘤易感基因，即使较少地暴露于危险环境因素下也发病[2]。在胃癌细胞中，Toll样受体4(TLR4)呈现高表达，且对胃癌的发生发展产生重要影响[3]。EB病毒(EBV)在多种肿瘤的发生过程中发挥促进作用，是一种重要的肿瘤相关病毒[4]。rs10759932、rs11536889是TLR4基因容易出现单核苷酸多态性的位点。TLR4基因rs10759932、rs11536889多态性与胃癌及EBV相关胃癌(EBVaGC)易感性的关系目前尚不明确。2015年10月～2016年2月，本研究观察了胃癌及EBVaGC患者TLR4基因rs10759932、rs11536889位点多态性，探讨其与胃癌和EBVaGC易感性的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择EBVaGC患者41例为EBVaGC组，其中男22例、女19例，年龄41～76岁；临床分期为Ⅰ期14例，Ⅱ期17例，Ⅲ期10例；病理分级为T1N06例，T1N18例，T1N26例，T2N16例，T3N05例，T2N2M010例。选择EBV阴性胃癌(EBVnGC)患者153例为EBVnGC组，其中男81例、女72例，年龄39～74岁；临床分期为Ⅰ期53例，Ⅱ期60例，Ⅲ期40例；病理分级为T1N021例，T1N132例，T1N226例，T2N114例，T3N020例，T2N2M040例。EBVaGC与EBVnGC患者在性别、年龄、临床分期、病理分级等方面有可比性。将EBVaGC、EBVnGC组患者合并为胃癌组，另选取性别、年龄匹配的100例健康体检者为对照组。排除感染、自身免疫病、肿瘤患者。入组者均来自山东地区汉族人群，且已签署知情同意书。

1.2 TLR4基因多态性检测方法 采用苯酚、氯仿-异戊醇抽提法提取所有受检者胃癌组织及血液中的DNA，TE缓冲液(pH 8.0)溶解干燥后的DNA，并于4 ℃冰箱保存备用。采用PCR结合限制性片段长度多态性(RFLP)技术检测TLR4基因rs10759932、rs11536889多态性。① rs10759932位点。PCR反应体系为25 μL，其中包括10×Buffer 2.5 μL，上下游引物(0.5 μmol/L)各1.25 μL，dNTPs (0.2 mmol/L)2.0 μL，DNA 模板3 μL，Taq DNA聚合酶1.0 U。PCR正向引物5′-TTTGTATAATTTGACTACCATTGCGT-3′，反向引物 5′- CATTTT-TTCACATCTTCACCAGC-3′。循环条件为：94 ℃预变性5 min，然后94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min共40个循环，最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶其中含溴化乙锭(0.5 μg/mL)中电泳，凝胶成像记录电泳结果。PCR实验中每次反应均用无菌双蒸水设立阴性对照。PCR扩增完成后，将5 μL PCR产物与0.5 μL限制性内切酶HhaI混合并加入10×Buffer 2.5 μL及纯水共25 μL混匀后瞬时离心，于37 ℃温育15 min进行酶切反应。酶切产物用4.0%的聚丙乙烯垂直凝胶电泳分离，溴化乙锭染色后成像系统记录电泳结果。GC↓GC序列为限制性内切酶HhaI的识别部位。②rs11536889位点。两对引物同时加入PCR反应体系进行扩增，直接鉴定基因型[5]。PCR正向引物1序列5′-TTTGATGGACCTCTGAATCTC-3′，反向引物1序列 5′-TTTTCTCAATGATAACATCCACTC-3′；PCR正向引物2序列5′- CTTGACCACATTTTGGGAAC-3′，反向引物2序列5′-TTCCAATTTCTCTATATCCTTGATGA-3′。该位点的PCR反应体系及反应条件和TLR4 rs10759932位点相同。PCR反应完成后，利用2.5% 琼脂糖凝胶电泳分离12 μL PCR产物，用溴化乙锭染色后凝胶成像系统观察并记录实验结果。

将25 μL PCR产物送华大基因有限公司采用末端终止法进行双向测序。测序结果用DNAStar(Larsergene7.0)及Chromas软件进行分析处理，并查找基因库中野生型TLRs相应的基因序列，与测序结果进行对比，对PCR-RFLP鉴定结果进一步验证。rs10759932位点：PCR产物酶切后电泳得到一条139 bp条带者为纯合野生基因型TT，得到117、22 bp两条带者为突变基因型CC，得到117、22、139 bp三条带者为杂合基因型TC。基因测序结果与上述判断相符。rs11536889位点：PCR产物酶切后电泳得到397、184 bp两条条带者为纯合子野生基因型GG，得到397、256 bp两条条带者为纯合突变基因型CC，得到397、256、184 bp三条扩增条带者为杂合基因型GC。基因测序结果证实上述判断。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。采用χ2检验或Fisher检验比较胃癌组与对照组、EBVnGC与EBVaGC患者基因型及等位基因频率的分布，并计算比值比(OR)及P值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

所有受检者中TLR4基因rs10759932、rs11536889基因型和等位基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡。

2.1 TLR4基因rs10759932位点多态性与胃癌及EBV感染的关系 胃癌组基因型TT者90例、TC者53例、CC者7例，等位基因T频数233(77.7%)、等位基因C频数67(22.3%)。对照组基因型TT者42例、TC者40例、CC者18例，等位基因T频数124(62.0%)、等位基因C频数76(38.0%)。胃癌组TT基因型频率明显高于对照组(χ2=14.373,P<0.01)。与携带CC基因型者相比，携带TT基因型者罹患胃癌的风险增加(OR=5.510,95%CI为2.138～14.202，P<0.01)。胃癌组和对照组等位基因T、C频率比较有统计学差异(χ2=14.423，P<0.01)。个体携带等位基因C可以降低罹患胃癌的风险(OR=2.131,95%CI为1.437～3.161,P<0.01)。胃癌组EBVaGC患者基因型TT者19例、TC者18例、CC者3例，等位基因T频数56(70.0%)、等位基因C频数24(30.0%)；EBVnGC患者基因型TT者71例、TC者35例、CC者4例，等位基因T频数177(80.5%)、等位基因C频数43(19.5%)。EBVaGC和EBVnGC患者基因型和等位基因分布相比，P均>0.05。

2.2 TLR4基因rs11536889位点多态性与胃癌及EBV感染的关系 胃癌组基因型为GG者95例、GC者54例、CC者4例，等位基因G频数244(79.7%)、C频数62(20.3%)。对照组基因型为GG者64例、GC者34例、CC者2例，等位基因G频数162(81.0%)、C频数38(19.0%)。两组基因型和等位基因分布相比，P均>0.05。胃癌组EBVaGC患者基因型GG者23例、GC者18例、CC者2例，等位基因G频数64(74.4%)、等位基因C频数22(25.6%)；EBVnGC患者基因型GG者72例、GC者36例、CC者2例，等位基因G频数180(81.8%)、等位基因C频数40(18.2%)。EBVaGC和EBVnGC患者基因型和等位基因分布相比，P均>0.05。

3 讨论

研究表明，TLRs基因某些位点多态性与肿瘤的遗传易感性、临床分期及患者预后密切相关[6]。其中包括位于9号染色体上，其cDNA全长为3 811 bp，包含4个外显子的TLR4基因。大量有关TLR4基因多态性的研究结果表明，其各位点的多态性可能与肿瘤的易感性有关[7～9]。例如，Garza-Gonzalez等[10]研究发现TLR4基因多态性(Asp299Gly、Thr399Ile)可能会导致持久的炎症，导致其携带者癌症的易感性明显增加；Hishida等[11]发现TLR4 rs11536889基因的多态性可以增加幽门螺杆菌阳性胃癌的易感性；Huang等[12]研究结果显示TLR4 rs10759932位点基因的多态性与胃癌易感性有关；还有研究发现TLR4基因rs11536889多态性和前列腺癌的易感性相关[13]。这些研究结果均说明人类一些炎症、恶性肿瘤的易感性可能与TLR4基因多态性之间存在某种联系。

本研究结果显示，TLR4基因rs10759932位点多态性与胃癌易感性有关，携带C等位基因者罹患胃癌的风险较低。此结果与Huang等[12]的研究结论一致。然而本研究结果显示，TLR4基因rs11536889位点多态性与胃癌易感性无相关性。之前有关该位点多态性的研究结果也有相同结论，例如Zhang等[14]报道TLR4基因rs11536889位点多态性与罹患胃癌的易感性无相关性。rs11536889位点位于TLR4基因的中心部位，因此该位点的多态性可能影响造成其mRNA的不稳定。有研究结果显示，在华人中携带等位基因C可以明显增加胃癌的易感性，但是在其他亚洲人和高加索人群中的相同研究却得出不同的结论[15]。还有学者研究发现该位点的多态性不仅与胃部肿瘤有关，而且与其他的一些炎症相关性肿瘤关系密切[16]。以上研究结论均提示基因多态性只是有关胃癌易感性的众多风险因素中的一个。

慢性炎症、免疫抑制或免疫刺激等因素均可以促进EBV活化和复制。微生物的内源性损伤相关模式分子和病原相关分子模式可通过刺激TLRs，从而激活免疫系统，进一步促进EBV阳性细胞的扩增[17]。研究证实在某些疾病发展过程中TLRs与EBV可以相互作用[18]。Yang等[19]发现TLR4基因T399I，其携带CT/TT基因型的人群罹患鼻咽癌的风险较高。然而本研究结果则显示，TLR4 rs11536889、rs10759932位点基因的多态性与EBV感染无相关性。这可能是由于EBVaGC组织中EBV编码基因的表达与其他EBV相关肿瘤例如鼻咽癌、Burkitt′s淋巴瘤等有一定的差异。有研究发现TLRs中部分成员通过激活LMP1而产生相关细胞因子，调节一系列相关基因的表达，从而导致疾病的发生。已有研究表明在EBVaGC组织中检测不到EBV细胞转化基因即潜伏膜蛋白(LMP1)，证明其编码基因是不能够表达的。这是因为EBV以Ⅰ型潜伏的形式存于EBVaGC中，即不能够表达LMP1。研究也进一步证明了EBVaGC具有其独特性，同时也提示TLRs基因多态性在EBVaGC中所发挥的作用与其在其他肿瘤组织中所发挥的作用是存在一定差异的。

总之，本次试验结果证明了TLR4 rs10759932位点的多态性与胃癌易感性有密切的关系，然而rs11536889位点的多态性与胃癌易感性无关。且TLR4基因 rs10759932、rs11536889位点多态性与EBV感染无关。但是本研究仍存在样本量较小等缺陷。因此我们应扩大EBVaGC样本量，增加慢性胃部炎症患者作为病例对照，且对TLR4编码基因的其他多态性位点进行检测，同时结合外界环境因素和宿主因素对胃癌形成的影响，进一步明确TLR4 基因多态性与胃癌以及EBV感染是否具有协同作用。

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施喜侠(E-mail: 13569535@qq.com)

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2017-05-12)