李克斌 田波/中农威特生物科技股份有限公司

口蹄疫免疫技术

李克斌 田波/中农威特生物科技股份有限公司

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触传染性的动物疫病，可快速远距离传播。侵染对象是猪、牛、羊等主要畜种及其它家养和野生偶蹄动物，易感动物多达70余种。发病动物的主要症状是精神沉郁、流涎、跛行、卧地，近查可见口、鼻、蹄和母畜乳头等无毛部位发生水疱，水疱破损后形成溃疡或斑痂。口蹄疫的发病率高，可造成巨大的经济损失和社会影响。该病是世界动物卫生组织（OIE)法定报告的动物传染病，我国将其列为一类动物疫病。

目前，口蹄疫仍然在世界许多地区流行，实践证明有效的疫苗免疫能够控制口蹄疫大范围的暴发和流行。世界动物卫生组织和泛美口蹄疫中心肯定灭活疫苗是防控口蹄疫的最有效手段。20世纪50年代，欧洲大部分国家开始实施计划免疫接种，达到了消除口蹄疫的目的。一些国家也利用这种政策，成为了OIE“免疫无口蹄疫国家”成员。

我国政府对口蹄疫的防控工作从未间断，非常重视，有比较健全的组织机构与防控体系。坚持实施 “预防为主、免疫和扑杀相结合”的综合防控措施，并取得了举世公认的成效。

一、口蹄疫疫苗及选用

1.口蹄疫疫苗的选用。免疫预防，疫苗是关键。人类自从发现了口蹄疫病毒，就开始了口蹄疫疫苗的研究。现在所用的灭活疫苗是高滴度的强毒生产之后经灭活处理获得，这种生产方式不仅存在散毒和污染环境的风险，还需要高效的生物安全设施和严格的操作规程。为此，我国政府对口蹄疫的研发和生产有严格的要求，由指定机构进行。中国农业部指定中农威特生物科技股份有限公司为唯一生产全系列口蹄疫疫苗的厂家。公司历史悠久，其前身是兰州兽医研究所的生物制品车间，从20世纪50年代开始，就开始了口蹄疫疫苗的研发和生产，为口蹄疫的防控发挥了举足轻重的作用。

防治口蹄疫等于防治七种病或多种病，免疫用疫苗毒株必须与流行毒株匹配，免疫才有效。因为，口蹄疫病毒在不断地发生着变异，有7个血清型，各血清型间无交叉免疫性，型内各毒株间的免疫原性差异很大，有的能够交叉保护，有的不能交叉保护。在病毒发生变异之后，原有的口蹄疫疫苗对新的流行毒株就有可能没有保护或保护力下降，所以在选用口蹄疫疫苗时，必须需要考虑血清型的一致性、毒株的匹配性，同时，还需要考虑疫病的流行强度，流行强度越大，需要的疫苗效力越高。

2.口蹄疫疫苗简介。口蹄疫疫苗的不断改进和使用，为口蹄疫的有效防控发挥了决定性的作用。随着口蹄疫疫情的变化，现已研制出了多种相关的疫苗，并有多种新型疫苗在研制的进程中。

（1）牛口蹄疫O型、A型双价灭活疫苗。2013年，口蹄疫的流行形势又发生了变化。以2010年出现的缅甸98毒株O型为主的口蹄疫威胁还没有减弱，又出现了茂名毒株的A型口蹄疫的流行。为此，中农威特公司立即启用了口蹄疫O型、A型双价灭活疫苗的战略应急储备技术。对工艺和设备等进行了升级改造，采用了最先进的和拥有自主知识产权的抗原浓缩和纯化等技术，全面提升了抗原的免疫原性和疫苗的效力。目前正在被大型养殖场所普遍使用，表现出了很好的防控效果。

（2）口蹄疫O型、亚洲I型、A型三价灭活疫苗（O/MYA98/BY/2010株+Asial/JSL/ZK/06株+Re-A/WH/09株）。本疫苗的优点是抗原谱广、保护性强，选用的制苗毒株既能预防现行优势流行毒株，又能覆盖、控制既往流行毒株。O型毒株选用2010年在广东白云区采集分离到的与目前流行毒株最为匹 配 的O/MYA98/BY/2010株，是当前O型口蹄疫防控的最佳制苗毒株。A型毒株为Re-A/WH/09株，通过人工改造基因，既能预防A/WH/09株，也能预防A/MM/2013株。Asial毒株选用的是Asial/JSL/ZK/06毒株，该制苗毒株所制造的疫苗为我国亚洲Ⅰ型口蹄疫的防控发挥了关键作用，有力地阻止了亚洲Ⅰ型口蹄疫在我国的蔓延。

（3）口蹄疫O型灭活疫苗（O/MYA98/BY/2010株）。口蹄疫O型灭活疫苗（O/MYA98/BY/2010株）是国家/OIE口蹄疫参考实验室和中农威特公司，为应对2010年突发的缅甸98（MYA/98）毒株口蹄疫疫情而研制的疫苗，可以预防猪、牛、羊等多种偶蹄动物的O型口蹄疫，广泛使用于全国口蹄疫的强制免疫接种和规模化养殖场口蹄疫的防控。口蹄疫O型灭活疫苗（O/MYA98/BY/2010株）对当前流行于我国的3个遗传谱系的5个典型O型口蹄疫代表毒株都具有很好的免疫效力，是抗原性和免疫效果优良的制苗毒株，可以满足我国当前和今后一段时期内预防O型口蹄疫的需要。

（4）口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗（Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株）。口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗（Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株）的最大特点是突破了传统制苗毒株的筛选技术，对制苗毒株的基因进行了人工改造，突破了常规疫苗种毒自然属性缺陷的限制，提升了疫苗种毒制备技术水平。大大地提高了制苗毒株的免疫原性和广谱性，使其在细胞中的增殖能力更强，抗原的敏感性、靶向性更好。该苗以口蹄疫病毒的复制、抗原性和致病性等前沿技术理论为指导，利用自主发明的单质粒口蹄疫病毒拯救技术系统（反向遗传操作系统，专利号：ZL201310175324.4），定向设计和优化改造疫苗种毒，构建出病毒产量、抗原匹配性、抗原稳定性等种用性能和安全性明显优于田间分离毒的疫苗种毒。结合中农威特公司的悬浮培养、抗原浓缩纯化等技术工艺，再次提升公司内控质量标准，生产出世界上第一个经过反向遗传学技术改造的口蹄疫高效灭活疫苗，具有很高的理论和技术创新。

（5）其他口蹄疫疫苗。目前，中农威特公司是经农业部批准生产全系列口蹄疫疫苗的唯一企业，公司产品成为国家口蹄疫疫病强制免疫和规模化养殖场自主免疫的主导疫苗，而且随着疫情形势的变化能够及时推出新的疫苗。除以上具有完全自主知识产权的口蹄疫疫苗之外，还出品口蹄疫A型灭活疫苗（独家生产），口蹄疫O型、亚洲1型二价灭活疫苗，口蹄疫O型合成肽疫苗等。

二、口蹄疫疫苗的储运

口蹄疫疫苗对酸、碱、热、紫外线敏感，偏酸、偏碱、过热、冻融和阳光曝晒均可使疫苗的有效成分降解，从而使疫苗的免疫效果降低甚至丧失。因此，疫苗必须在在2℃～8℃的温度下全程冷链运输和保存才能保证其效力。

疫苗运输时，要妥善包装，防止运输过程中发生损坏，使其尽快入库和/或到达目的地。

疫苗保存时要有相应的冷藏设施和温度检测设备，还要避光防潮、分类存放。

疫苗出、入库应有记录，使用时采取“先入先用”的原则，即先入库先出库，先用失效期近的，后用失效期远的。

三、口蹄疫免疫操作技术

免疫接种口蹄疫疫苗涉及一系列操作，每步操作都存在着很多技术问题，只有掌握技术，科学操作，才能确保免疫成功。否则，不仅直接影响免疫效果，产生接种应激等，而且还有可能延误疫情的防控，给养殖场带来毁灭性的打击。

1.免疫前的准备

（1）接种器具的准备与消毒灭菌。应按动物的种类和大小选用适合的接种器具，确保将疫苗打入肌肉层。要做好注射器具的清洗、消毒灭菌工作，避免污染。在消毒针头前，应仔细检查，若针尖处有钩丝、堵塞则不能使用，以减少对被免疫动物的的应激和感染。免疫时要及时更换针头，做到一畜一针头。

注射器具可用湿热方法或高压灭菌，条件不具备时用干净水加热煮沸灭菌。经灭菌的注射器和针头要置于无菌盒内，防止污染。

煮沸灭菌时，加水淹没器械2cm以上，煮沸30min，待冷却后放入灭菌器皿中备用。灭菌后的器械应当日使用，当日不用打开后，需重新灭菌，方能使用。

不建议对注射器具用化学方法消毒，因为大部分化学药物容易残留，影响疫苗免疫效果。

使用一次性无菌塑料注射器时，要检查其包装是否完好和是否在有效期内。一次性物品用过后，应注意销毁，防止污染环境。

（2）疫苗的检查与回温处理。使用前应对疫苗进行眼观质量检查，主要检查包装、瓶体是否完好无破损，标签是否与实物一致。运输、保存不符合2℃～8℃、二维码信息不准确、瓶体破损、瓶体内颜色异常、有异物、分层的不能使用。

使用时，将疫苗回温到20℃～25℃进行免疫接种，可有效减少冷应激。

（3）接种前动物检查。免疫前要充分了解接种动物的品种、健康状况、饲养情况、免疫及发病史。有病、瘦弱、刚配种10～15 d内的母畜、临产母畜（30 d内）最好不要接种，等到病畜康复和母畜产后再进行补免。

（4）免疫前小范围试验。初次使用疫苗的地区或养殖场，应先进行小范围试验（约30头），无不良反应后，方可扩大接种范围。

2.免疫注意事项

科学免疫，减少应激反应，倡导“四打”“四不打”。

“四打”：(1)免疫接种仅对健康牲畜进行；（2）在动物处于休闲、非应激状态下进行免疫接种；（3）将免疫接种安排在气候适宜的时间段，如在炎热季节，应选在清晨或者傍晚进行；（4）经过长途运输后的动物，充分休息24 h以上再进行免疫接种。

“四不打”：（1）动物在宰杀前20 d之内不要对其进行免疫接种；（2）天气突变、转群、断奶、换料、吃料、饱腹期间暂不要进行免疫接种；（3）对患病、瘦弱牲畜，及断奶前幼畜暂不接种，待牲畜康复、恢复正常后方可免疫接种；（4）配种10～15 d内的母畜、临产母畜（30 d内）最好不要接种，等到母畜产后再进行补免。

人员要求：（1）接种工作要求由经过培训的专业人员严格遵守操作规程，在更换衣服、鞋、帽和消毒之后进行。

（2）接触过病畜人员，不应再参加安全畜群的免疫接种，以防疫病的传播。若必须参加，则一定要通过淋浴、洗头、换衣、咳痰和隔离一整夜后，方可进行免疫操作。

紧急免疫接种：（1）紧急情况下，如疫病暴发时，对疫区和受威胁区尚未感染的动物应该紧急免疫接种，以形成免疫隔离带。（2）疫苗对安全区、受威胁区及疫区牲畜均可使用。必须依序免疫接种，先接种安全区的牲畜，然后再接种受威胁区的牲畜，最后接种疫区内的牲畜。

刚经过长途运输的新引进动物，必须充分休息后方可接种疫苗，一般以休息24 h以上较为合适。紧急情况下，如疫病暴发时，对没有感染的动物应该迅速接种，特殊情况下应灵活决定。

疫苗注射时，针头应与与体表呈90°垂直注入，确保将疫苗注入肌肉内，不可注入脂肪层或者皮下。接种部位应选择在颈部和臀部肌肉比较厚的部位，接种时应对动物的注射部位进行剪毛消毒。免疫接种口蹄疫疫苗时，不要同时接种其它疫苗。

使用前和使用过程中，应将疫苗充分摇匀，但切不可剧烈振荡，以防气泡产生。已经吸出的疫苗不可再回注于疫苗瓶内。如果注射剂量大，可分点注射。禁止以“飞针”方式注射，以避免造成疫苗注射剂量不够和注射部位不准确。疫苗瓶开启后，疫苗应当天用完且做好免疫记录。注射时不能用一个注射器吸取两种疫苗混用。

免疫是预防疫病的重要手段之一，同时，还需加强饲养管理、消毒和对其他疾病的防治。

3.疫苗免疫接种

疫苗接种要严格按照说明书规定的接种途径、剂量、注意事项，以及科学的免疫程序进行。

免疫程序是通过大量科学试验制定的。免疫程序的制定必须要考虑到当地疫情状况、动物的饲养管理（如断奶时间、营养、转群、饲养期等）、动物的母源抗体水平、疫苗抗原的免疫性、疫苗抗原含量、免疫次数、接种动物的反应性等。因此，根据免疫效果，需要在实践中不断总结和完善。

尤其是基础免疫，首先应该考虑当地的疫情状况，其次要考虑机体母源抗体水平或原有的抗体水平、首免时间、基础免疫次数及剂量。首次免疫后，必须在一个月内加强免疫一次，然后间隔3～4月加强免疫一次。

程序（仅供参考）：首次使用O、A双价疫苗必须要在30 d以内加强一次；母畜剂量2 ml为佳，一年3～4次；所产仔畜50日龄左右接种2 ml，30 d后再打一针，然后间隔3～4个月加免一次，每次每头2 ml；未免疫或免疫间隔长的母畜所产仔畜，则提前到28～35日龄或更早开始。

四、免疫不良反应的观察与预防

接种疫苗后个别动物可能会产生不良反应。一般的不良反应表现为，个别动物注射部位轻微肿胀，体温升高0.5℃～1℃，减食或停食1～2日，奶牛可出现一过性泌乳量减少，随着时间延长，症状逐渐减轻消失。因品种、个体的差异，个别动物接种后可能会出现由过敏原引起的严重不良反应，如焦躁不安、呼吸加快、肌肉震颤、可视黏膜充血、瘤胃鼓气、鼻腔出血等，甚至因抢救不及时而死亡；少数怀孕母畜可能出现流产。出现严重过敏反应时，应及时使用肾上腺素、地塞米松等药物进行抢救，同 时采用适当的辅助治疗措施。

五、免疫效果检测

免疫动物的血清抗体水平与抗强毒侵袭的免疫保护有一定的正相关。因此，抗体监测能够间接反映免疫接种效果和水平，为制定合理免疫程序提供依据。对于已经实施了免疫接种的动物，必需监测免疫动物的群体抗体水平，以评估动物群体的免疫水平和抗感染能力。

接种口蹄疫疫苗时要求应免动物100%免疫率，免疫抗体效价合格率达到70%以上。若免疫合格率较低，免疫效果不理想，未达到国家规定的抗体效价合格率水平，应当分析原因、采取措施、及时补免，提高免疫效果。同时，也要结合流行病学、临床症状、血清学指标、预防效果等对免疫效果做出综合性判断。

监测程序（仅供参考）：

采血时间：猪免疫28d后，其他畜21 d后，进行免疫效果监测。

监测方法与抗体合格率判定标准：

亚洲I型口蹄疫：液相阻断ELISA；抗体效价≥26判定为合格。

O型口蹄疫：灭活类疫苗采用正向间接血凝试验、液相阻断ELISA，合成肽疫苗采用VP1结构蛋白ELISA；灭活类疫苗抗体正向间接血凝试验的抗体效价≥25判定为合格，液相阻断ELISA的抗体效价≥26判定为合格；合成肽疫苗VP1结构蛋白抗体ELISA的抗体效价≥25判定为合格。

A型口蹄疫：液相阻断ELISA；抗体效价≥26判定为合格。

口蹄疫疫苗的应用，已使口蹄疫的疫情得到了有效的防控，大幅度地减轻了疫情的危害。中农威特公司开展的《针对新传入我国口蹄疫流行毒株的高效疫苗的研制及应用》荣获了国家科学技术进步二等奖，国家现已启动了亚洲I型口蹄疫免疫全面退出、开展非免疫无疫建设工作，我国口蹄疫控制策略获得世界动物卫生组织（OIE）颁证认可等等事实显示，有步骤、有计划地实施免疫接种口蹄疫疫苗，可以增强动物抵抗口蹄疫病毒的能力，有效预防和控制口蹄疫的暴发和流行，有效地保证了畜牧业的发展，使人类朝着最终消灭口蹄疫的方向前进。