伍旭明 许亚萍

浙江省中医院 浙江 杭州 310006

夏枯草对胆管癌细胞增殖及凋亡的作用*

伍旭明 许亚萍#

浙江省中医院 浙江 杭州 310006

夏枯草 人胆管癌细胞 增殖 凋亡

胆管癌是一种起源于胆道上皮的少见的恶性肿瘤，手术仍是目前主要的治疗手段，但手术后生存率较低[1]。有研究表明夏枯草对多种肿瘤具有抑制作用，但是目前夏枯草对胆管癌的研究较少。因此本研究主要探讨夏枯草对胆管癌QBC939和RBE细胞的作用，为临床中医辅助治疗胆管癌提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂:夏枯草购于福建中医药大学国医堂医院。小牛血清、低糖DMEM培养基、胰蛋白酶等试剂均购自GIBICO公司；MTT、Hoechest33258、DMSO，内参购自sigma公司。Trizol为Invit rogen公司产品；逆转录试剂盒、dNTP、Taq DNA聚合酶为promega公司产品。由上海生工生物工程有限公司合成引物。

1.2 细胞培养:人QBC939、RBE胆管癌细胞购自上海中科院细胞库,将细胞培养于含10%的胎牛血清,1×105IU/L青霉素及125mg/L链霉素，低糖DMEM培养基中，在37℃、5%CO2条件下进行培养，取生长至对数生长期的细胞用于实验。

1.3 实验方法:分述如下。

1.3.1 药品的制备:对药材以水煎法提取2h，加入75%的乙醇进行溶解，获得夏枯草的粗提物，取夏枯草粗提物适量，精密称定，溶解于DMSO中。经高压灭菌后，于-20℃冰箱中保存。实验时母液用DMEM培养基进行稀释，获得所需要的干预浓度。DMSO最终浓度控制在1%以下。

1.3.2 MTT比色实验:取对数生长期细胞（1×105），用胰酶(EDTA)进行消化，接种于96孔培养板，待24小时细胞贴壁RBE后，加入不同浓度（50、100、200μg/ml）的夏枯草，每个药物浓度设置5个复孔。设阴性对照组、阳性对照组顺铂(5g/ml)、空白对照组。细胞分别培养24、48、72h后，每孔加入浓度为5mg/ml MTT/PBS液l0μl，继续培养4h后，弃上清，每孔中加入150μl二甲基亚砜溶解沉淀，在摇床上充分振荡l0min，使结晶物溶解。在酶标仪上选择570nm波长，测定各孔光吸收度值，计算夏枯草对胆管癌QBC939和细胞的抑制率。抑制率按公式计算:P抑制(%)=［(1-D药物组)/D对照组)]×100%。

1.3.3 Hoechst 233258:取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×105，置于24孔板中。待细胞贴壁，加入100μg/ml的夏枯草，作用48h后，去掉培养基，用PBS洗涤细胞2次，4%的甲醇在4℃条件下固定细胞10min后，加入Hoechst233258染液(用PBS稀释成5μg/ml)，在室温条件下，细胞染色15min，选择波长356nm，荧光显微镜(奥林巴斯FV1000)下观察各组细胞的形态并摄像。

1.3.4 细胞凋亡测定:待细胞生长至对数生长期,收集细胞胰酶消化后,调整细胞浓度为1×106/ml，种于6孔培养板中，细胞贴壁后，用低、中、高剂量组50、100、200μg/ml的夏枯草分别处理48h后，离心收集细胞，冷PBS洗涤细胞2次，70%冷乙醇固定细胞，置入4℃冰箱中过夜保存备用。细胞在染色前用PBS洗去固定液，离心1000rpm，5min。加入500μl结合缓冲液重悬细胞，再各加5μl AnnexinⅤ-FITC及PI溶液，涡旋后，4℃避光孵育30min，进行流式细胞仪分析细胞凋亡率实验重复3次。细胞凋亡的分析应用Becton Dickinson FACS分析系统和Mul ticycle软件进行。

1.4 统计学方法:采用SPSS18.0统计软件作统计分析。所有计量资料以±s表示,采用单因素方差分析进行组间差异的比较。以P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 夏枯草对QBC939和RBE细胞凋亡的影响:见表1。

表1 夏枯草对QBC939和RBE细胞凋亡的影响（±s）

表1 夏枯草对QBC939和RBE细胞凋亡的影响（±s）

注：与阴性对照组比较，*P＜0.01。

组别空白对照组阴性对照组阳性对照组50μg/ml 100μg/ml 200μg/ml QBC939 12.32±0.32 12.52±0.38 35.20±0.52*14.01±0.52 43.25±0.35*53.15±0.42*RBE 12.45±0.38 12.60±0.47 35.64±0.65*14.25±0.58 44.02±0.46*54.25±0.48*

2.2 夏枯草对QBC939和RBE细胞增殖抑制率的影 响:见表2。

表2 夏枯草对QBC939和RBE细胞增殖抑制率的影响（±s，%）

表2 夏枯草对QBC939和RBE细胞增殖抑制率的影响（±s，%）

注:与空白对照组比较，*P＜0.0l。

组别空白对照组阴性对照组阳性对照组50μg/ml 100μg/ml 200μg/ml QBC939 0—0.01±0.04 0.01±0.04 0.01±0.04 0.01±0.04 0.01±0.04 24—1.20±0.26 28.58±0.40*1.60±0.32 33.42±0.45*48.78±0.35*48—1.59±0.28 39.26±0.36*2.79±0.96 44.73±0.52*58.98±0.74*72—2.01±0.43 49.02±0.53*3.83±0.30 51.43±0.51*70.12±0.43*RBE 0—0.01±0.04 0.01±0.04 0.01±0.04 0.01±0.04 0.01±0.04 24—1.18±0.29 28.62±0.46*1.62±0.37 33.48±0.49*48.58±0.35*48—1.56±0.31 39.33±0.40*2.82±0.98 44.76±0.56*59.04±0.76*72—2.12±0.48 49.13±0.59*3.85±0.35 51.51±0.56*70.20±0.48*

2.3 夏枯草对QBC939和RBE胆管癌细胞形态的影响: QBC939(B)以及RBE(C)细胞经Hoechst233258染色后，在荧光显微镜下，观察细胞形态发生的变化。对照组（A）细胞核呈圆形，处理组（B,C）细胞出现皱缩，核发生碎裂，有凋亡小体出现，出现典型的凋亡改变。见图1。

图1 夏枯草对QBC939和RBE胆管癌细胞形态的影响

3 讨论

夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunel la vulgaris L．的干燥果穗，因“夏至后即枯”而得名，是一味清火、明目、散结、消肿的传统中药,早在《神农本草经》中就记载“夏枯草，味辛、苦，主寒热瘰疬，头创，破瘕，散瘿，结气……”。现代临床经验证明单味夏枯草或与其他药配伍，对治疗肺癌、乳腺癌、脑胶质细胞瘤、淋巴瘤 等多种恶性肿瘤，均有较为满意的效果[2]。夏枯草作为一种廉价、低毒、有效的抗肿瘤中药，越来越引起人们的广泛关注。

胆管癌的发病率目前逐年升高，其发病的原因不明，化疗是治疗胆管癌的一项重要手段，但缺乏敏感且有效的化疗药物[3]。因此，寻找有效的化疗药物是目前临床的一项重要任务。现代临床研究表明单味夏枯草或者其复方对淋巴瘤、血管瘤、甲状腺肿瘤等恶性肿瘤，疗效较好。目前夏枯草对胆管癌的研究较少，本研究主要探讨夏枯草对胆管癌细胞株QBC939，RBE增殖及凋亡的影响。细胞的发生快速增殖是肿瘤细胞的主要特征之一，控制癌症发展的一个重要途径是遏制肿瘤细胞的快速增殖。胆管癌细胞QBC939及RBE经不同浓度的夏枯草分别处理24、48、72小时后，采用MTT法检测细胞增殖的抑制情况。研究结果显示，经中、高浓度（100、200μg/ml）夏枯草处理的胆管癌细胞，细胞的增殖抑制率增高，并随着夏枯草药物浓度的增加，作用时间的延长而增高，与对照组相比，有统计学差异。提示夏枯草能抑制胆管癌细胞QBC939及RBE的增殖，并呈时间浓度依赖性。肿瘤的发生、发展和细胞的凋亡密切相关。细胞凋亡是细胞在一定的生理或者病理条件下，在内在基因的调控下，细胞自动结束生命的一个过程。细胞凋亡时，细胞呈现染色质固缩、细胞核破碎，凋亡小体形成等特征性变化。本研究结果显示，胆管癌细胞QBC939及RBE经100μg/ml的夏枯草处理48小时后，胆管癌细胞呈现典型的凋亡形态改变，而对照组细胞没有发生凋亡形态的变化。同时流式细胞仪检测结果显示,经不同浓度（50、100、200μg/ml）夏枯草处理后细胞的凋亡率增加，与对照组相比，差异有统计学意义，并呈浓度依赖性。提示夏枯草能诱导胆管癌细胞株QBC939及RBE的凋亡参与抑制胆管癌的作用。本次研究结果与翁金月等[4]的研究报道基本一致。

综上所述，研究表明在体外夏枯草能显著抑制QBC939及RBE胆管癌细胞的增殖，并诱导其凋亡，为临床辅助胆管癌的治疗提供了实验基础，但其具体作用机制有待进一步深入研究。

[1]Wang H,Wang J,Wang H L.Mul tivariate analysis of survival rates in patients with hi lar cholangiocarinoma[J].J Surg Concepts Pract,2014,19(5):80-89.

[2]窦景云.夏枯草药理作用及临床应用研究进展[J].现代医药卫生，2013，29(7):1039-1041.

[3]国际肝胆胰学会中国分会,中华医学会外科学分会肝脏外科学组.胆管癌诊断与治疗——外科专家共识[J].中国实用外科杂志,2014,34（1）:1-5.

[4]翁金月,郑良朴,张春椿.夏枯草促人结肠癌细胞凋亡的实验观察[J].浙江中医杂志,2014,49（10）:772-774.

2016-09-16

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