温永平1，侯强川，张和平

(1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，呼和浩特010018；

2.内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018）

自然发酵酸马奶对人体肠道菌群的影响
——基于PacBio SMRT测序技术

温永平1，侯强川2，张和平2

(1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，呼和浩特010018；

2.内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018）

采用PacBio SMRT测序技术研究了内蒙古锡林郭勒盟地区一名健康志愿者在连续饮用酸马奶60 d前后肠道菌群的变化。结果表明，连续饮用酸马奶可以增加志愿者肠道菌群的丰度和多样性，使志愿者肠道菌群更加趋于健康化。此外，志愿者肠道中存在大量的“肠道核心微生物群”，饮用酸马奶会使志愿者肠道中硬壁菌门的相对含量升高。在种的水平上，饮用酸马奶可以促进部分有益生菌如柔嫩梭菌群、多形拟杆菌的生长，这可能是酸马奶具有众多益生作用的原因之一。

酸马奶；肠道菌群；PacBio SMRT测序技术

0 引言

酸马奶是以新鲜马奶为原料，经乳酸菌和酵母菌等微生物共同自然发酵形成的酸性、低酒精含量的乳饮料[1]。在酸马奶流行的国度，民众普遍认为酸马奶是一种可以预防肠道紊乱、调节免疫平衡、辅助治疗肺结核等慢性疾病的益生食品[2]。肠道菌群对人体的健康起着十分重要的作用，众多的研究已经表明肠道菌群与肥胖[3]、二型糖尿病[4]、机体免疫[5]等众多疾病有着密切的联系。2013年4月发布的PacBio RS II测序平台凭借其超长的读长可以使研究者准确获得样本中微生物种水平的组成[6-8]。

本研究采用PacBio SMRT测序技术研究了内蒙古锡林郭勒地区一名健康志愿者在连续饮用酸马奶60天前后粪便菌群的变化，首次在种的水平上揭示了长期饮用酸马奶对人体肠道菌群的影响。

1 实验

1.1材料和方法

1.1.1 样本来源

本研究志愿者来自内蒙古锡林郭勒盟，在实验前的三个月及实验期间该志愿者没有服用任何抗生素。在实验期间，志愿者每天饮用750 g某医院生产的酸马奶，持续60 d。分别采集志愿者0 d（D0）和60 d（D60）时的粪便样品，妥善保存后用于后续分析。

1.1.2 DNA提取和PCR扩增

使用德国QIAGEN公司生产的QIAamp DNA Stool Mini Kit粪便DNA提取试剂盒提取样品微生物基因组DNA，具体操作按照试剂盒中的使用说明书进行。总DNA提取以后分别使用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检验DNA样品的完整度、纯度以及浓度，上述3个条件都满足后续实验要求的DNA样品暂存到-20°C冰箱备用。

DNA扩增采用细菌16S通用引物，正向引物序列为27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)，反向引物为1492R(5'-ACCTTGTTACGACTT-3')。在每对引物的前后两端分别加有16个碱基长度的barcode用于区别不同样品。PCR反应体系和扩增程序按照文献[9]中描述的进行。

1.1.3 PacBio测序

PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检验合格后，使用太平洋生物技术公司SMRTbellTM template prep kit 1.0试剂盒构建DNA测序文库，具体操作按照试剂盒使用说明书进行。使用P6-C4试剂用于测序反应。

1.2数据处理与作图

原始下机数据使用SMRT®Portal（V2.7）中的RS_ReadsOfinsert.1方案进行测序质量控制。具体的质控参数包括最小循环测序次数、最小预测准确度、最短插入片段长度和最大插入片段长度，上述参数的设定值分别为5，90，1 400和1 800。质控后合格的序列根据barcode序列拆分不同的样本，与此同时删除各序列的barcode和引物信息以进行后续的分析。使用QIIME（V1.7）平台对来自两个样本的序列进行物种和多样性分析，具体的处理流程参考文献[10]中的描述进行，主要的处理过程包括：（1)PyNAST校准并把序列排齐，在100%相似性下进行UCLUST归并，建立无重复的16S rRNA全长序列集；（2）在98.65%相似度[11]条件下划分分类操作单元（Operational taxonomic units，OTU）；（3）使用ChimeraSlayer去除OTU代表性序列中属于嵌合体的序列；（4）使用RDP（Ribosomal Database Project，Release 11.5）和Greengenes（Release 13.8）数据库对OTU代表性序列进行同源性比对，整合两个数据库的比对结果，确定每个OTU最终的分类学地位；（5）使用FastTree软件绘制基于OTU代表性序列的系统发育进化树，随后计算样品的α多样性。最后使用R软件（V3.3.2）对QIIME产生的结果进行分析和可视化处理。

2 结果与分析

2.1测序深度评估

经过测序和质控，D0和D60分别获得的序列数为6 896条和4 928条。经过PyNAST对齐和100%相似度uclust聚类，共得到9491条非重复序列，进一步按照98.65%相似度划分OTU并去除属于嵌合体的OTU后，得到5238个OTU（表1）。

图1为两份粪便样品的稀疏曲线和Shannon曲线。由图1a可知，两份样品的稀疏曲线均未进入平台期，这说明随着测序量的增加，有可能会有新的种系型被发现；而由图1b可以发现，在当前测序深度下，样品的shannon多样性曲线已经接近水平状态，这说明随着测序量的增加，虽然有可能会发现新的种系型，但当前的测序量已能够揭示出样品中大部分的微生物组成。

图1 两份粪便样品的稀疏曲线和Shannon曲线

2.2样品细菌丰度和多样性分析

为了比较饮用酸马奶前后，志愿者肠道菌群整体物种和丰度的差异，本文取两个样本在测序深度为4810时计算得到的α多样性值。在该测序深度下，D0样品的Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数和Observed species指数的值分别为20202.9，8.55，0.980，2062.79；D60样品上述指标对应的值分别为49443.3，9.40，0.988，2540.24（表1）。由上述指标的值可知，无论是基于Shannon和Simpson指数的物种多样性评价指标还是基于Chao1和Observed species指数的物种丰度评价指标均表明，长时间连续饮用酸马奶可以在一定程度上提高宿主肠道菌群物种的丰度和多样性。众多的研究成果表明，肠道菌群多样性是宿主健康的重要指标之一，肠道菌群多样性的缺失和自闭症、炎症性肠病（IBD）、反复梭状芽孢杆菌相关性腹泻、肥胖相关性炎症等疾病密切相关[12-15]，而老年人群中多样性的增加则和健康水平有关[16]。在本研究中，志愿者在连续饮用酸马奶60 d后，其肠道菌群物种丰度和多样性均有一定程度的升高，尤其是Chao1指数的值在饮用酸马奶以后升高了一倍以上，预示着饮用酸马奶可使志愿者肠道菌群更加趋于健康化。

2.3样品菌群OTU水平的共性和差异分析

基于OTU水平的Rank-abundance曲线显示（图2a），在排序最靠前的前174个OTU中，来自两个样品的曲线具有极高的吻合度，这说明两个样品排序较靠前的OTU在各自的样品中所占的比例比较接近。为了验证两份样品是否共享了相对含量较高的这部分OTU，本研究进一步基于至少包含两条序列的OTU绘制了两个样品的Venn图（图2b）。从图上可以看出，至少包含两条序列的OTU共有400个，这些OTU包含的序列数为6796条，占所有质控后合格序列的比例为57.9%。其中D0和D60共享的OTU数目为66个，共包含的序列数为4576条。此外，分别有227个OTU和107个OTU是D0样品和D60样品所独有的，包含的序列数分别为1124条和1096条。上述结果表明，饮用酸马奶前后两份样品共享的OTU数目虽少，但包含的序列数却很多，这部分OTU所代表的微生物类群有可能是该志愿者的“肠道核心微生物群”。此外，每份样品还有很大数量独有的OTU，但这部分OTU包含的序列数相对较少，这进一步说明，饮用酸马奶前后主要优势菌种始终存在，但一些低丰度的物种会随着酸马奶的饮用消失或出现。上述结果与Zaura E[17]等基于口腔微生物群的研究结果相吻合。Zaura E利用测序技术，检测了3名正常高加索人口腔内5个部位(牙齿表面、脸颊、硬腭、舌和唾液)的微生物菌群构成，证实了健康人口腔内存在很大比例的“核心微生物组”。

表1 样品的测序序列信息和α多样性指数

图2 基于OTU水平的Rank Abundance曲线和Venn图

2.4饮用酸马奶前后志愿者粪便菌群相对含量的比较分析

通过和Greengene数据库及RDP数据库比对注释，结果发现在门的水平上，D0样品和D1样品相对含量在1%以上的菌门分别包括拟杆菌门（Bacteroidetes，70.21%）、硬壁菌门（Firmicutes，28.35%）、变形菌门（Proteobacteria，1.31%）和拟杆菌门（54.02%）、硬壁菌门（45.44%）。值得注意的是，变形菌门在D60样品中的相对含量比较低，仅占总测序序列数的0.17%。这与Jiachao Zhang[18]等基于中国314个不同民族人群肠道菌群的分析结果一致，这项研究的结果发现在健康中国人的肠道菌群中，含量最高的四大门类分别为硬壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门，但不同个体间上述菌门的含量存在一定的差异。本研究中，志愿者在饮用酸马奶后，肠道中硬壁菌门/拟杆菌门（F/B）的值由0.40升高为0.84，这说明在饮用酸马奶期间，志愿者肠道菌群结构发生了较大程度的改变。

在属的水平上，两份样品共发现了41个不同的属。其中平均相对含量在1%以上的菌属共有11个（图3a），分别为拟杆菌属（Bacteroides）、Faecalibacterium、Roseburia（罗氏菌属）、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）、梭菌属（Clostridium）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、真杆菌属（Eubacterium）、Parabacteroides、Alistipes、Dorea、巨单胞菌属（Megamonas）。上述菌属在D0样品中的相对含量分别为65.90%，6.64%，0.20%，7.89%，2.95%，2.37%，3.40%，3.05%，1.15%，1.67%，0%；在D1样品中的相对含量分别为49.53%，9.63%，10.67%，0.76%，5.57%，3.18%，0.78%，0.92%，2.56%，0.35%，2.00%。其中，巨单胞菌属在D0样品中没有被检测到。饮用酸马奶后相对含量升高的菌属有Faecalibacterium、罗氏菌属、梭菌属、瘤胃球菌属、Alistipes。含量下降的菌属有拟杆菌属、考拉杆菌属、真杆菌属、Parabacteroides、Dorea。

在种的水平上，两份样品共检测到87个菌种，其中平均相对在1%以上的菌种有12个（图3b），占测序序列总数的67.96%。这些菌种分别为Bacteroides dorei、单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）、柔嫩梭菌群（Faecalibacterium prausnitzii）、Roseburia faecis、Phascolarctobacterium faecium、卵形拟杆菌（Bacteroides ovatus）、直肠真杆菌（Eubacterium rectale）、Parabacteroides distasonis、粪拟杆菌（Bacteroides caccae）、多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）、Alistipes putredinis、活泼瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus）。上述菌种在D0样品中的相对含量分别为32.52%，14.15%，6.64%，0，7.89%，5.48%，2.99%，2.47%，2.15%，0.64%，0，1.90%；在D60样品中的相对含量分别为25.30%，7.20%，9.63%，9.94%，0.76%，1.22%，0.02%，0.41%，0.58%，1.63%，2.19%，0.17%。饮用酸马奶以后升高的菌种包括柔嫩梭菌群和多形拟杆菌，其余菌种相对含量均出现了一定程度的下降。此外，Roseburia faecis和Alistipes putredinis是在饮用酸马奶后新出现的菌种。

Harry Sokol等人[19]的研究发现柔嫩梭菌群数量的下降会增加手术后克罗恩病的复发率，并且建议将柔嫩梭菌群作为益生菌摄入以用于克罗恩病的治疗。Louis P等人[20]的研究则发现，柔嫩梭菌群可以利用醋酸，同时产生丁酸，对肠道的健康具有潜在的益生作用。多形拟杆菌能够分解人体自身无法消化的多糖如纤维素等，在向宿主提供营养的同时也为肠道中的其他细菌提供食物。Sonnenburg J L等人[21]的研究发现，多形拟杆菌可以根据小鼠饲喂饲料的不同改变糖代谢相关基因的表达水平，以适应外界环境的变化，帮助实验小鼠消化吸收营养物质。在本研究中，该菌数量的上升有可能与其能比较快的适应外界环境改变有关。对于饮用酸马奶后Roseburia faecis和Alistipes putredinis的来源还需要进一步实验来确定。

图3 在属和种的水平上2份样品的主要菌群构成

3 结论

本研究发现连续饮用酸马奶可以增加志愿者肠道菌群的丰度和多样性，使志愿者肠道菌群更加趋于健康化。志愿者肠道中存在很大数量的“肠道核心微生物群”，这部分菌群在志愿者饮用酸马奶前后一直都存在，但一部分低丰度的肠道菌群会随着酸马奶的饮用消失或出现。此外，饮用酸马奶会使志愿者肠道中硬壁菌门的相对含量升高，同时促进部分益生菌如柔嫩梭菌群、多形拟杆菌的生长，这可能是酸马奶具有众多益生作用的原因之一。

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Effect of natural fermented Koumiss on human gut microbiota——based on PacBio sequencing technology

WEN Yongping1,HOU Qiangchuan2,ZHANG Heping2
（1.Inner Mongolia Mengniu Dairy(Group)Co.Ltd.，Huhhot 010018,China；2.Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering Ministry of Education ministry Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China）

The PacBio SMRT sequencing technology was used to detect the changes of intestinal microflora in a healthy volunteer from Inner Mongolia Xilingol League before and after sixty consecutive days of drinking Koumiss.It was found that continuous drinking of Koumiss could increase the abundance and diversity of volunteer intestinal flora,so that the volunteer tend to have more healthy intestinal flora.There was a large number of“core gut microbiota”in the intestinal tract of the volunteer.Drinking Koumiss will increase the relative abundance of Firmicutes and promoting some probiotics such as Faecalibacterium prausnitzii and Bacteroides thetaiotaomicron,which may be one of the reasons for the beneficial effect of Koumiss.

Koumiss;gut microbiota;PacBio SMRT sequencing technology

TS252.56

A

1001-2230（2017）02-0004-04

2016-09-20

农业部现代农业产业技术体系建设项目（CARS-37）。

温永平（1974-），男，高级工程师，从事乳品质量管理。

张和平