杜晓敏，刘文俊，张和平

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018）

传统酸马奶发酵过程中挥发性风味物质动态变化研究

杜晓敏，刘文俊，张和平

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018）

以采集自内蒙古地区的酸马奶为研究对象，在其发酵过程不同时间段的发酵引子等时间点采集样品，利用SPME-GC-MS检测法测定其挥发性风味物质种类和含量，研究其动态变化。结果表明：鲜马奶的挥发性风味物质种类可达约35种，显著多于成熟的酸马奶，随着发酵时间的延长风味物质种类减少。鲜马奶中风味物质以醛类、酸类、酯类、含氮化合物和分子量较大的芳香族化合物为主。贮藏10 d以上的发酵引子，其中风味物质只有17种，而且酸马奶发酵期间风味物质趋向于生成小分子类的酸、醇、酯等化合物。本研究旨为传统酸马奶的品质改良和风味改善提供理论依据。

酸马奶；SPME-GC-MS；风味物质

0 引言

酸马乳，在蒙古语中又称马奶酒、策格，酸马奶是以新鲜马乳为原料，经过乳酸菌和酵母菌混合发酵而成。经临床研究发现，酸马乳具有降血压、降血脂等作用[1-3]。发酵乳中风味物质的来源大体有3种途径：原料乳自身的挥发、加工工艺产生和微生物代谢形成的挥发性化合物[4]。关于酸奶风味提取方法，国内外报道较多为固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术[5]，SPME具有灵敏度高、检出限低等特点。

本研究以采集自内蒙古地区的鲜马奶为研究对象，采用SPME技术对鲜马奶和酸马奶发酵过程中的风味物质进行富集，利用GC-MS技术进行组分分析，通过对比分析鲜马奶、酸马奶风味物质组成差异与变化情况，了解其变化规律，为酸马奶的发酵控制和优良产品的开发提供理论基础。

1 实验

1.1 材料和仪器

1.1.1 样品采集

本研究选择内蒙古锡林郭勒地区3个沿用传统方法制作传统酸马奶的牧民家庭（编号为：1，2，3采样点），分别采集150 mL鲜马奶，不同发酵时间的酸马奶（0，3，6，9，18 h）和发酵引子（10 d以上）样品，置于液氮罐冻结，迅速运回实验室置于-80℃保存，然后依据实验要求进行后续实验。

1.1.2 仪器设备

气相色谱-质谱连用仪(Anilent 7890BGC sys⁃tem-5977A MSD)；色谱柱为HP-5毛细管柱(30 m× 0.25 mm，0.25 μm)；手动固相微萃取(SPME)进样手柄(USA,SUPELCO)，萃取头(65 μm PDMS/DVB；USA, SUPELCO)。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

取待检样品10 mL置于20 mL装有磁力搅拌子的顶空采样瓶中，50℃恒温水浴中加热平衡60 min，将手动SPME进样器固定在SPME搭载装置上，并将针头插入顶空瓶中，推出萃取纤维，顶空吸附萃取30 min。吸附时间结束以后，将萃取头插入GC-MS进样口250℃解析3 min。

1.2.2 挥发性风味物质测定

GC条件：采用程序升温方式，起始温度40℃，保持3 min，以4℃/min升温速率上升至140℃，保持1 min，以10℃/min上升至250℃，保持3 min；汽化室温度为250℃；载气为He，流速1.0 mL/min；不分流进样。

MS条件：电离方式为EI源，电子能量70 eV；离子源温度230℃；质量扫描范围m/z 33～450 AMU；发射电流100 μA。

萃取条件：平衡温度为50℃，平衡时间为60 min。解吸附条件：250℃条件下解吸附3 min。

1.2.3 定性与定量分析

利用随机携带Masshunter工作站NIST 1.1标准库自动检索各组分质谱数据，利用面积归一化法计算各组分相对相对峰面积比（即每种风味物质组分峰面积占离子色谱图中所有风味物质总峰面积的百分比)。

2 结果与分析

每一种乳制品都有其独特的风味特性，这种特性主要是由其中所含的特征风味物质种类和含量决定的[6]。酸马奶具有丰富的营养价值取决于它种类繁多的风味物质。风味物质的数量和种类与菌株分解代谢蛋白质、脂肪、乳糖的能力有关。这些代谢产物对酸马奶的风味及质地的形成中有着非常重要的作用。本研究采用SPME-GC-MS方法对鲜马乳、酸马乳发酵期间（0，3，6，9，18 h）和大于10 d的发酵引子不同阶段样品中的挥发性风味物质进行了检测分析，共检测出60多种风味物质(表1)。

图1鲜马奶、酸马奶贮藏期间挥发性风味组分部分总离子流

图1 可以看出，鲜马奶、酸马奶发酵期间风味物质种类丰富，分离效果好。由表1可以看出，鲜马奶、酸马奶不同阶段总共分离得到的风味物质有酸类化合物、醇类化合物、酯类化合物、醛类化合物、酮类化合物、碳氢类化合物、含氮化合物、芳香族化合物和其他共9大类风味物质，种类最多的是酯类化合物。其中鲜马奶共检测出约35种成分，上述九大类风味物质全部包含，鲜马奶挥发性风味物质在3个采样点的总体组成上差别不大，从风味物质种类上来看，以醛类化合物、酸类化合物、酯类化合物、含氮化合物和芳香族化合物为其主风味物质。由图2可以看出，酸马奶在0，3，6，9，18 h及大于10 d的发酵引子分别检测到15，9，15，16，21，17种成分，风味物质种类整体较鲜马奶减少，在酸马奶3 h风味物质种类最少，随着发酵时间的延长，风味物质种类又有所增加，而且酸马奶发酵过程中，又有一些新的风味物质出现，这可能是由酸马奶所含有的特殊有益微生物决定的，而酸马奶的有益微生物主要由乳酸菌和酵母菌两大部分组成，正是这些微生物共同作用，通过分解代谢转化，比如可能将马奶中大分子集团分解代谢成小分子化合物等，使得酸马奶发酵过程中风味物质种类数量有较大差异。综合分析认为，对酸马奶风味贡献度较大的是酸类化合物、醇类化合物、酯类化合物，这些风味物质构成酸马奶的主体风味物质。同时发酵过程中产生二氧化碳赋予酸马奶独特的杀口感。

图2 鲜马奶、酸马奶发酵期间风味物质种类

2.1 发酵过程中酸类物质动态变化

酸类物质是酸马奶的主风味物质之一，本实验通过SPME技术检测得到酸类物质鲜马奶4种，酸马奶7种。鲜马奶三个采样点检测有辛酸、n-癸酸、n-癸烯酸、月桂酸4种成分，相对峰面积比（以三个采样点的相对锋面积比的平均值加减标准差表示，没有标准差的表示只有一个采样点检测到）分别为（39.0± 14.59）%，（32.74±11.76）%，4.82%，（5.04±0.36）%。辛酸、n-癸酸含量相对较多，n-癸烯酸只在鲜马奶的一个检测点出现。酸马奶发酵0、3、6、9、18 h，大于10 d的发酵引子出现的酸类物质变化差异较大，在发酵0 h，得到酸类物质3种即辛酸、n-癸酸、1-丁醇-3-甲基乙酸，相对锋面积比分别为25.31%，25.43%，1.42%；在发酵3 h，第一次出现乙酸，相对峰面积比为16.2%，未检测到其他物质。乙酸是许多发酵奶制品重要的风味物质，并且它与柠檬酸代谢有关，是乳酸菌通过分解柠檬酸得来[7-8]。在发酵6 h，主要的酸味物质有辛酸、n-癸酸，相对峰面积比为61.95%，2.84%，月桂酸在此时再次出现，随着发酵时间的延长持续并稳定存在，相对峰面积比较鲜马奶有所减少，但相对稳定处于一个平台期；在发酵9 h，主要的酸味物质有辛酸、月桂酸，乙酸第二次出现，相对峰面积比为69.99%，2.13%，1.32%，乙酸含量较3 h明显减少；在发酵18h，酸类物质种类有所增加，有6种，但乙酸从此消失，主要有辛酸、n-癸酸、月桂酸、羟基乙酸、己酸，相对峰面积比分别为89.1%，45.81%，1.65%，8.45%，11.97%，辛酸含量达到最高；在大于10 d的发酵引子中，风味物质种类减少，主要有辛酸、月桂酸，相对峰面积比为53.51%，1.17%。虽然酸类在含量上并不是最大，但却是体现酸马奶保健功能特色的主要部分。比如，乙酸中的乙酰基在生理代谢过程中与辅酶A结合，可以参与碳水化合物和脂肪的新陈代谢，有助于能量的合成与分解[9]。己酸的氨基化物-6-氨基己酸，对于抑制体外纤溶系统、减少术后失血有积极作用[10-11]。而辛酸可以促进胃排空，利于消除功能性消化不良患者的临床症状[12]。

2.2 发酵过程中醛类物质动态变化

醛类化合物是马奶中重要的风味物质，过多的乙醛会带来青草臭味[13]。醛类化合物在发酵乳风味物质中所占比例较低属于微量香气成分，但对发酵乳风味构成有重要影响。由表1可以看出，只有鲜马奶中检测到有醛类物质共9种，而酸马奶在0，3，6，9，18 h及大于10 d的发酵引子均未检测到该类物质。在鲜马奶3个采样点，得到的醛类物质有戊醛、己醛、2-己烯醛,(E)-、庚醛、2.4-庚二烯醛,(E,E)-、辛醛、壬醛、2-庚烯醛,(E)-、2-辛烯醛,(E)-，相对峰面积比分别为（6.12±3.42）%，（11.77±4.95）%，（1.59±0.53）%，（3.96± 1.62）%，（7.24±3.62）%，（1.82±0.64）%，（2.01±0.45）%，（1.91±0.78）%，1.79%。可见所有醛类物质在三个采样点都有检测到，只有2-辛烯醛,(E)-在一个采样点出现，戊醛、己醛、2.4-庚二烯醛,(E,E)-含量相对较高。综合分析认为鲜马奶在三个采样点得到的醛类物质在种类数量上差异不大。酸马奶发酵期间未检测到该类物质，一部分原因可能是因为微生物作用将醛类物质转化为乙酸、乙醇等物质，赋予了酸马奶柔和的醇香味。对于典型的醛类物质乙醛，通过SPME萃取没有检测到，可能是在GC-MS分析过程设有溶剂延迟，而经查阅文献，乙醛出峰时间在溶剂延迟以内，可能被掩盖。

2.3 发酵过程中酯类物质动态变化

本实验所测风味物质酯类化合物种类最多，共19种，鲜马奶较酸马奶种类多。酯类化合物是发酵乳中重要的风味物质之一，酸奶中的醇类物质与游离氨基酸结合可以形成酯类化合物[14]。很多酯类物质的风味阈值较低，虽在检测结果中质量分数较低，但酯类物质对发酵乳的风味影响很大。鲜马奶中检测到的酯类物质种类较多，得到13种，由表1可知，鲜马奶三个采样点得到的物质种类差异不大。鲜马奶中检出如丁酸甲酯、丁酸乙酯、己酸甲酯、n-己酸乙烯酯、辛酸甲酯、丁酸-2-乙基-1,2,3-三丙酯、4-癸烯酸甲酯、癸酸甲酯等，在酸马奶发酵期间均消失，辛酸甲酯在鲜马奶中相对峰面积最大，达到(75.43±43.75)%，而像己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯在鲜马奶中检测出现，相对锋面积比为1.48%，（7.99±2.59）%，1.77%，在酸马奶发酵期间（除3 h外）也持续稳定存在，化合物辛酸乙酯在酸马奶发酵期相对峰面积比达到100%并保持稳定。在酸马奶发酵期间酯类物质种类呈增加趋势，新增出现的酯类物质有乙酸乙酯、丙酸-2-羟基乙酯, (S)、反-4-癸烯酸乙酯、月桂酸乙酯、dl-2羟基-己酸乙酯、壬酸乙酯，在酸马奶3 h得到的酯类物质最少，只检测到一种即乙酸乙酯，其相对峰面积比为70.2%，随着发酵时间的延长，整体有减少趋势，但不成线性。酸马奶发酵期间酯类物质种类变化差异不大，但较鲜马奶明显减少，这可能是因为酸马奶发酵期间微生物作用将一些酯类物质分解代谢消失或者转化成了其他物质。Cheng H等[14]报道，大多数酯类物质都具有水果和花香味道,可能有助于降低发酵乳中脂肪酸和胺的尖锐、苦涩味道。

2.4 发酵过程中醇类物质动态变化

酸马奶的醇味主要由乙醇形成[15]。醇类化合物的风味阈值较高，因此对发酵乳的风味影响不及醛类，酯类等物质。本实验酸马奶醇类物质种类较鲜马奶多，鲜马奶检测到3种醇类物质即1-戊醇、2-（己氧基）-乙醇、2,7-二甲基-1-辛醇，而这三种醇类物质在酸马奶发酵期均消失。酸马奶发酵期间得到醇类物质4种，在酸马奶0 h，出现乙醇，相对峰面积比为12.64%,在发酵3 h乙醇相对峰面积比达最大100%，随着发酵时间的延长，乙醇持续存在，但相对峰面积比都较3 h时减少。酸马奶发酵期间还检测到醇类物质有3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、苯乙醇，其中3-甲基-1-丁醇在酸马奶发酵期及发酵引子都有检测到，持续稳定存在，也是主风味物质之一，苯乙醇在发酵18 h出现，相对峰面积比为7.08%，在发酵10 d以上的发酵引子中存在且质量分数减少，相对峰面积比仅为1.33%。

表1 酸马奶发酵过程中不同时间点挥发性风味物质种类及质量分数

（续表1）

2.5 发酵过程中酮类物质动态变化

酮类多由不饱和脂肪酸的氧化、热降解、氨基酸降解或微生物代谢产生[16]。本研究所得的酮类物质种类较少，鲜马奶4种，酸马奶1种。鲜马奶检测到4种成分为2-庚酮、2-壬酮、1-戊烯-3-酮、3.5-辛二

烯-2-酮,(E,E)-，前两种成分相对峰面积比较后两种大且在鲜马奶采样点变化差异不大，而后两种物质只在鲜马奶的一个采样点检测到。同时，这4种成分在酸马奶发酵期间消失。酸马奶发酵期仅检测到一种酮类物质即3-羟基-2-丁酮，只在发酵3h出现并随着发酵时间的延长消失，相对峰面积比为10.48%。3-羟基-2-丁酮是嗜热链球菌发酵糖类时产生的特征风味化合物[17-18]，其中3-羟基-2-丁酮（乙偶姻）具有强烈的奶油香气[19-20]，对增加酸乳的奶香味发挥了重要作用。双乙酰是发酵乳风味物质中主要的酮类物质，对发酵乳风味的形成起着重要的作用。本研究没有检测到双乙酰，可能因为在检测时间点之间，双乙酰在酶的作用下被还原为乙偶姻。

2.6 发酵过程中碳氢类物质动态变化

本研究只在鲜马奶中检测有4种碳氢类化合物，酸马奶发酵期间未出现该类物质。4种成分为2,4-二甲基-庚烷、4-甲基-辛烷、壬烷、癸烷，相对峰面积比分别为1.12%，1.12%，1.75%，（1.87±0.16）%，可知在鲜马奶三个采样点变化差异明显，前三种成分只在一个采样点出现，只有癸烷三个采样点均出现。酸马奶中未检测到该类物质可能是因为马奶在发酵过程中将这些碳氢类物质当作能量提供物分解利用转化成了其它的化合物。

2.7 发酵过程中含氮类物质动态变化

酸马奶营养丰富的原因之一是微生物可使马奶中部分蛋白质转化成游离氨基酸，使人体更易消化吸收[21]。马奶和酸马奶的氨基酸组成及其含量与人奶非常相近，并且人体所有必需的氨基酸在马奶和酸马奶中含量更高[22]。本实验得到含氮类化合物鲜马奶较酸马奶多，鲜马奶4种，酸马奶3种。鲜马奶采样点检测得到4种成分即氨基甲酰肼、丁腈-2,3-氧代二肟双乙酰、甲氧基-苯基-肟、2-硝基-1-丁烯-3-醇，其中氨基甲酰肼，甲氧基-苯基-肟在鲜马奶采样点变化差异不大且相对锋面积比较大，分别为（58.75± 11.87）%，（22.63±6,27）%，而且这两种成分在酸马奶发酵期间也存在，氨基甲酰肼在酸马奶发酵期间变化差异较明显，相对锋面积比较鲜马奶减少，在发酵3 h相对锋面积比达到最大为51.86%，之后随着发酵时间的延长相对锋面积比显著减少，在发酵18 h减少到1.90%，大于10 d的发酵引子未出现该物质。另两种成分丁腈-2,3-氧代二肟双乙酰和2-硝基-1-丁烯-3-醇只在鲜马奶一个采样点有检测到，相对锋面积比较小，分别为1.8%，1.3%，这两种成分在酸马奶发酵期间均没有出现。在酸马奶发酵18 h新增出现一种含氮类物质即乙酸铵，相对锋面积比为6.74%，在大于10 d的发酵引子也有检出，相对锋面积比为3.01%。

3 结论

本研究使用SPME萃取技术富集结合运用GC-MS分离检测，较全面的分析了鲜马奶、酸马奶发酵期间不同阶段及发酵引子的挥发性风味成分。研究结果发现鲜马奶，酸马奶不同阶段总共分离得到的风味物质有酸类化合物、醇类化合物、酯类化合物、醛类化合物、酮类化合物、碳氢类化合物、含氮化合物、芳香族化合物和其它共九大类风味物质。鲜马奶的挥发性风味物质种类较成熟的酸马奶多。鲜马奶中风味物质种类可达约35种，但是以醛类化合物、酸类化合物、酯类化合物、含氮化合物和分子量较大的芳香族化合物为其主风味物质。随着发酵时间的延长，马奶在发酵过程中的挥发性风味物质种类在减少，发酵10 d以上的发酵引子，其中风味物质有17种，而且酸马奶发酵期间主风味物质趋向于生成酸类化合物、醇类化合物、酯类化合物。通过主成分分析可知，酸马奶的发酵各阶段挥发性成分随时间变化明显，但不成线性。这可能是由于不同阶段测得挥发成分数量不同而导致，这种可能性在整个分析过程中均存在。同时，鲜马奶和发酵期间不同时间段酸马奶中挥发性风味物质在种类、数量及相对峰面积比上的差异体现了鲜马奶、酸马奶发酵期间的风味特征。

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Study on the dynamic change of volatile flavor compounds in traditional fermented koumiss

DU Xiaomin,LIU Wenjun,ZHANG Heping
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering,Ministry of Education,P.R.China,Inner Mongolia Agricul⁃tural University,Hohhot 010018，China)

In this paper,traditional koumiss collected in Inner Mongolia were regarded as the research object.The samples of fresh mare’s milk and koumiss at different fermented time(0,3,6,9,18 h and longer than 10 days)were collected respectively.The concentration and kinds of flavor compounds were dynamically studied by using SPME-GC-MS.The results showed that kinds of flavor compounds in fresh mare’s milk were 35 kinds,which were significantly more than in koumiss.The flavour compounds in koumiss was decreased with the fer⁃mentation time elongation.The major flavour compounds in fresh mare milk were macromolecular compounds including acetaldehyde,ac⁃ids,esters,nitrogen-containing compound and aromatic compounds.There were only 17 flavour compounds in the aged starter koumiss stored more than 10 days,and these compounds include small molecules compounds such as acid,alcohol,esters and so on.It maybe provide the theoretical foundation for the improvement of flavour and quality of traditional koumiss in the present paper.

Koumiss；SPME-GC-MS；flavor compounds

TS252.54，TS252.56

A

1001-2230（2017）05-0004-06

2016-08-10

国家自然科学基金(31671871)。

杜晓敏（1990-）女，硕士研究生，研究方向为乳品生物技术及加工工程。

张和平