凡军民　贾君　陈燕

摘要：分析江苏茅山地区蝉花（Isaria cicadae Miquel）中脂肪酸的组成，建立了同时测定蝉花中十六酸甲酯、油酸甲酯和亚油酸甲酯3种脂肪酸含量的方法。采用气相色谱-质谱联用法分析蝉花中脂肪酸的组成，并用气相色谱法对其主要脂肪酸进行定量分析。结果表明，蝉花中主要有8种脂肪酸，十六酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯分别在50～500 μg/mL（r=0.999 9）、100～1 000 μg/mL（r=0.999 5）、20～200 μg/mL（r=0.999 3）线性关系良好，平均回收率分别为97.66%、98.13%、97.33%，RSD分别为1.02%、0.73%、1.03%（n=9）。

关键词：蝉花（Isaria cicadae Miquel）；气质联用；气相色谱；脂肪酸；含量测定

中图分类号：TS207.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）04-0727-04

蝉花（Cordyceps cicadae）又称金蝉花、蝉花虫草、蝉蛹草，是虫草科（Claviceplaceae）棒束孢属（Isasia）的寄生蝉类若虫形成的虫生真菌，为中国传统的中药材[1，2]。其具有清热、解毒、驱风、镇痛和明目等多种功效。与名贵中药材冬虫夏草的无性同属，且具有相似的化学成分及药用价值[3，4]。现代临床研究表明，蝉花具有调节免疫功能[5-7]、抗肿瘤[7-10]、改善肾功能[11，12]、促进造血[13]等药理作用。

蝉花化学成分复杂多样，主要集中在核苷类物质、多糖、多球壳菌素、麦角甾醇等生物活性成分的研究[11，14]，关于脂肪酸成分及含量的研究报道较少。本研究采用GC-MS法分析江苏茅山地区蝉花中脂肪酸的成分，并用GC法测定其中3种主要脂肪酸十六酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯的含量，为蝉花中脂肪酸的鉴别和含量测定提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 AL 204型电子分析天平，梅特勒·托利多公司；MD 200型氮气吹扫仪，杭州奥盛仪器有限公司；Agilent 7890A GC-5975C MSD型气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司。

1.1.2 试药 正己烷（色谱纯）、正十八烷（产品编号40037161，沃凯GCS）由国药集团化学试剂有限公司提供，十六烷酸甲酯（标物编号SH-N-16-M-100 mg）、亚油酸甲酯（标物编号111625）、油酸甲酯（标物编号190034）均由北京万佳首化生物科技有限公司提供。蝉花产自江苏省句容市磨盘山。

1.2 方法

1.2.1 標准溶液配制

1）内标溶液的配制。精密称取0.146 5 g正十八烷，置于50 mL容量瓶中，用环己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，质量浓度为2.93 mg/mL。

2）对照品溶液的配制。a.精密称取十六烷酸甲酯对照品250 mg，置于50 mL容量瓶中，用正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，质量浓度为5 mg/mL。b.精密称取油酸甲酯对照品100 mg，置于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，质量浓度为10 mg/mL。c.精密称取亚油酸甲酯对照品100 mg，置于50 mL容量瓶中，用正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，质量浓度为2 mg/mL。d.混合标准溶液：十六酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯各取1.0 mL，定容于10 mL容量瓶，质量浓度分别为0.5、1.0、0.2 mg/mL。

1.2.2 样品制备

1）蝉花预处理。将蝉花去泥洗净，50 ℃烘至恒重，粉碎，过60目筛，备用。

2）蝉花脂肪酸的超声提取。精密称取0.5 g蝉花粉末，置于具塞试管中，加正己烷10 mL，超声（功率300 W，频率40 kHz）30 min，放冷，过滤，重复2次。将2次的抽提液合并，用N2气将滤液吹干（50 ℃），重复6次。取3次重复，用2 mL正己烷复溶，混匀，过0.22 μm滤膜，作为供试溶液，备用。

3）脂肪酸的甲酯化处理。在吹干的蝉花脂肪酸中加入0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液1 mL，摇匀，40 ℃水浴加热10～15 min，取出冷却，加入内标溶液 0.2 mL、正己烷1.8 mL，静置10 min，取上清液，过 0.22 μm滤膜，作为供试溶液，备用。

1.2.3 分析方法

1）气相色谱条件。HP-5MS型毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），程序升温：初始温度190 ℃，保持17 min，30 ℃/min升温至220 ℃，保持1 min，5 ℃/min升温至280 ℃；进样口温度280 ℃，FID 检测器温度290 ℃；载气高纯氮气，流速1 mL/min；进样量1 μL，分流比20∶1。

2）质谱条件。EI电离源，电离电压70 eV；离子源温度250 ℃；接口温度290 ℃；离子源扫描质量范围（m/z）50～550；溶剂延迟5 min；通过NIST11标准谱库检索，并与标准图谱核对进行定性分析，按面积归一化法进行定量，测得其相对百分含量。

2 结果与分析

2.1 蝉花中脂肪酸成分的GC-MS分析

采用GC-MS法分析蝉花脂肪酸，其成分的总离子流色谱见图1。对各峰进行分析，共鉴定出8种脂肪酸类成分。由表1可以看出，蝉花脂肪酸有3种主要成分，分别为十六酸甲酯、亚油酸甲酯、油酸甲酯。

2.2 色谱条件与系统适用性

在“1.2.3”色谱条件下分析，按“1.2.2”方法制备供试溶液，3种脂肪酸甲酯色谱峰之间的分离度均大于1.5，表明相邻色谱峰达到完全分离，色谱图见图2。

2.3 线性关系考察

分别取混合对照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，加内标溶液0.1 mL，用正己烷定容至2 mL，摇匀，即得5个浓度混合对照品溶液。将混合对照品溶液按“1.2.3”色谱条件测定，重复进样3次，记录各成分峰面积值。以峰面积比（A对照品/A内标）为纵坐标，浓度比（C对照品/C内标）为横坐标，绘制标准曲线并计算回归方程。十六酸甲酯、亚油酸甲酯、油酸甲酯的回归方程分别为Y=0.070 7X+0.002 4（r=0.999 9），Y=0.380 0X+0.006 3（r=0.999 5），Y=0.017 6X+0.005 6（r=0.999 3），在50～500 μg/mL、100～1 000 μg/mL、20～200 μg/mL范圍内3个脂肪酸甲酯的标准曲线线性关系好。

2.4 精密度试验

取混合对照品溶液1.2 mL，加内标溶液0.1 mL，用正己烷定容至2 mL，摇匀，重复进样6次，以峰面积比（A对照品/A内标）计算精密度，测得A十六酸甲酯/A正十八烷的RSD为1.47%；A油酸甲酯/A正十八烷的RSD为1.48%； A亚油酸甲酯/A正十八烷的RSD为1.47%，符合试验要求。

2.5 稳定性试验

取甲酯化处理后的脂肪酸供试溶液，分别于0、4、8、12、24 h进样，记录峰面积值。十六酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、峰面积的RSD（n=6）分别为3.3%、3.1%、3.0%，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2.6 重复性试验

取蝉花粉末6份，按“1.2.2”方法制备供试溶液，气相色谱仪测定，测得十六酸甲酯平均含量为0.26%，RSD为2.51%；测得油酸平均含量为1.86%，RSD为2.68%；亚油酸平均含量为0.54%，RSD为2.56%，表明样品制备的重复性好。

2.7 加样回收率试验

精密称取蝉花粉末0.5 g，共9份，加入适量不同浓度脂肪酸甲酯对照品溶液，按“1.2.2”方法制备供试溶液，气相色谱仪测定。十六酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯平均回收率和RSD见表2。

2.8 含量测定

精密称取蝉花粉末6份，按“1.2.2”方法制备供试溶液，气相色谱仪测定。以保留时间定性，根据外标法以峰面积定量，由标准曲线计算脂肪酸的含量。蝉花中十六酸、油酸、亚油酸的含量（w）分别为（0.26±0.09）%、（1.86±0.14）%、（0.54±0.11）%。

3 讨论

3.1 主要脂肪酸的确证

通过GC-MS法确证了江苏茅山地区蝉花中8种脂肪酸成分，采用GC法同时测定其中3种主要脂肪酸成分十六酸甲酯、油酸甲酯和亚油酸甲酯的含量。蝉花中油酸甲酯和亚油酸甲酯2种不饱和脂肪酸含量较高，相对百分含量分别为9.27%、62.39%，益于心、脑、肾、血管的健康。研究表明，油酸对肿瘤、肉癌、乳癌、肺癌及B细胞白血病等癌症显示出强的活性，在肿瘤的预防和治疗中发挥了积极的作用。亚油酸是人体不能合成或是合成的量远不能满足需要的必需脂肪酸，具有降低血脂、血压，软化血管，促进微循环作用，能预防动脉粥样硬化及心脑血管疾病。因此，蝉花中不饱和脂肪酸油酸和亚油酸的含量与相关药理学的关系有待进一步研究。

3.2 色谱条件的选择

采用150～180 ℃柱温作为初始温度，除溶剂峰外，色谱图基本没有峰；以190 ℃作为初始温度进行程序升温，结果色谱峰的分离效果较好且基线平稳。样品采用分流进样20∶1，测定用样品含量在标准曲线内，色谱峰并能完全分离。

3.3 提取方法的选择

采用超声提取、索氏提取2种方法进行提取，蝉花中脂肪酸相对含量分别为17.32%、14.42%，索氏提取法提取脂肪酸比超声提取法高3%；用索氏提取法提取测得蝉花中十六酸、油酸、亚油酸的含量（w）分别为（0.27±0.05）%、（2.35±0.16）%、（0.61±0.08）%，2种方法提取的十六酸、亚油酸含量无差异，索氏提取法提取测得蝉花中油酸含量高于超声提取法。索氏提取法方法较繁琐、加热回流时间较长，因此选择超声提取。

4 小结

本研究采用超声提取法提取蝉花中脂肪酸，用GC-MS法对其成分进行定性分析，并对其中十六酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯3种主要脂肪酸的含量测定。经方法学考察，该检测方法重复性好，气相色谱图基线平稳，可用于蝉花中脂肪酸含量的测定。

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