傅忠星，杨 帆，王 灵，张宏伟，曹广文

人鼠嵌合肝小鼠模型的建立及在HBV致病研究中的应用

傅忠星，杨 帆，王 灵，张宏伟，曹广文

病毒性肝炎一直是全球范围内一个沉重的肝病负担，其中以乙型肝炎最为严重。由于HBV仅感染灵长类动物，因此其所致肝病很难在动物模型中被复制。人鼠嵌合肝小鼠模型是指将人源肝细胞移植入免疫缺陷的肝损伤小鼠肝内而形成的嵌合体小鼠。由于小鼠肝内嵌合有人肝细胞，可以在其体内模拟HBV的感染，利于进行进一步的机制研究。目前该模型主要以白蛋白启动子调控尿激酶（Alb-uPA）小鼠模型和延胡索酰乙酰乙酸水解酶（Fah-/-）小鼠模型为基础，在人源肝组织和外周血中均可检测到HBV，并已应用于HBV突变、HBV基因功能、抗病毒药物效果以及HBV与免疫系统的相互作用等方面的研究。本文就传统HBV感染动物模型的利弊、人鼠嵌合肝小鼠模型的研究进展和改进方法进行综述。

小鼠模型；乙型肝炎病毒；免疫缺陷小鼠；人源化小鼠；人鼠嵌合肝

HBV引起的乙型肝炎作为一种传染性强、致癌率高的疾病，多年来一直危害着人类的健康，引起全球疾病负担的加重。HBV感染不仅能够引起急、慢性病毒性肝炎，而且能够诱导肝硬化（liver cirrhosis, LC）和肝细胞癌（hepatocellular cancer, HCC）的产生。世界上3/4以上的HCC患者和约1/3的LC患者是由HBV慢性感染所致[1-2]，而每年因肝衰竭和HBV相关肝癌死亡的病例超过100万[3]。针对HBV进行预防和控制，明确HBV具体致病机制对于减轻全球疾病负担具有重要的意义[4]。

多年来，研究者针对HBV开展了大量的研究，但是HBV的致病过程涉及范围广泛，单一的肝组织细胞培养实验不足以支持该病的相关研究，因此，对HBV感染动物模型的需求与日俱增。然而在自然状态下，HBV感染宿主的范围有限，仅侵袭灵长类动物（人类和黑猩猩），大大限制了构建HBV感染动物模型的可能性。前期的一些研究分别利用不同的动物模型进行HBV相关的研究。但是，由于这些动物模型均无法充分模拟HBV在自然状态下对人体的感染过程，使得通过动物模型证实HBV在肝脏急性炎症、慢性纤维化和癌症的发生发展过程的作用难以实现[5]。缺乏可用于探索肝炎病毒感染、复制、致病机理的动物模型阻碍了人们对HBV致病机制的深入认识和治疗方式的发展。所以，寻找一种简便、有效、稳定的HBV感染的动物模型是目前研究的主要方向之一。近年来研究人员用人的原代肝细胞直接移植到模型动物体内形成人源化鼠嵌合肝动物模型，逐渐获得了认可。本文在总结所有HBV动物模型研究的基础上对人鼠嵌合肝小鼠模型及其所取得的进展进行综述。

1 传统乙型肝炎动物模型及其弊端

1.1 黑猩猩模型 黑猩猩在实验条件下可被HBV感染，由于其是与人类亲缘关系最接近的灵长类动物，且感染病毒亚型与接种亚型一致，表现出与人类急性乙型肝炎相似的免疫反应，是研究HBV感染过程中宿主抗病毒反应以及评价疫苗和药物疗效的最佳模型[6]。通过黑猩猩模型，发现HBV感染的肝细胞损伤主要由免疫介导，且特异性CD8+T细胞在病毒清除和病理损伤中起关键作用[7]。但是，黑猩猩感染HBV后症状较人类轻，很少发展为急性重型肝炎，且慢性率也较人类低，加上黑猩猩等非人灵长类动物多属濒危物种，其在研究方面的应用受到很大限制。若使用黑猩猩作为模型，其花费过于庞大，无论从伦理还是从经济因素来考虑，现阶段不适合用灵长类动物模型作为研究模型[8]。

1.2 树鼩模型 树鼩在系统进化上与灵长类关系密切，且在接种HBV后能在肝脏中检测到HBV的感染和复制，在疾病后期发展成为肝细胞癌，为HBV致癌这一过程提供了动物实验依据[9-10]。然而树鼩感染过程多为一过性，其体内HBV感染过程的短暂性使其不适于HBV慢性感染的研究，也不利于慢性乙型肝炎治疗措施的评价，对于该模型还须深入探索[11]。

1.3 土拨鼠模型 土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus, WHV）与HBV同属嗜肝DNA病毒。WHV感染的土拨鼠可发生慢性感染并易发生HCC[12]。WHV模型是研究慢性乙型肝炎感染机制、免疫病理学和免疫治疗的有效模型，但由于其遗传背景与HBV遗传背景差异明显，从该模型得到的结论并不能完全真实的反映HBV在人体内的状态[13]。

1.4 鸭模型 鸭乙型肝炎病毒（duck hepatitis B virus, DHBV）和WHV、HBV同属嗜肝DNA病毒。DHBV感染鸭后，基因组主要以共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）的形式存在，且在细胞内高度稳定[14]。DHBV感染模型分布广泛、价格经济、易饲养且实验中易于操作，曾被广泛应用于HBV基因突变、细胞表面病毒受体、病毒清除机制以及筛选新的抗病毒药物的研究。但是，鸭与人类的遗传背景差异较大，免疫背景不明确，检测手段相对缺乏，加之上述肝炎病毒与HBV的种属差异，所观察到的现象并不能完全真实的反映人类感染HBV的情况[15]。

1.5 小鼠模型

1.5.1 转基因小鼠模型 转基因小鼠模型是最常见的HBV小鼠模型，通过导入不同的HBV片段，研究人员分别构建出不同类型的HBV转基因小鼠[16-17]。HBV虽然不能感染转基因小鼠，但HBV全基因组转基因小鼠的肝脏可复制和分泌HBV，该模型在研究HBV的复制及其与宿主的相互作用方面发挥了一定的作用[18]。此外，利用转基因鼠模型可以确定特定序列的特定作用，如高表达HBx抗原的转基因鼠虽然没有任何的肝脏疾病特征，但却最终产生肿瘤，说明HBx有可能是HBV发挥致癌作用的关键因素[19-20]。

HBV转基因鼠模型的主要缺陷在于HBV产生于基因组中转入的1段HBV序列，病毒无法彻底被清除。此外，HBV转基因小鼠由于是在胚囊中注射，免疫系统对其基因产物不识别，无法模拟出肝脏炎症，无法进行炎癌转化研究，无法模拟人类乙型肝炎的免疫病理变化，因此与HBV自然感染存在一定差异[21]。

1.5.2 高压水动力小鼠模型 高压水动力小鼠模型采用高压水动力将含HBV基因组的表达质粒经尾静脉注射入小鼠，可观察到病毒复制与抗原表达，在提高HBV基因组在小鼠肝脏的表达效率的同时避免了免疫耐受。但是随着小鼠体内出现HBV特异性抗体和细胞毒性T淋巴细胞，HBV的复制仅能维持半个月左右，使水动力模型HBV复制持续时间较短、感染细胞数量有限，尚无法模拟慢性HBV感染病程，重复性较差。因此该模型对HBV慢性感染机制研究及药物筛选等方面存在明显的不足[22]。

1.5.3 病毒载体介导小鼠模型 利用腺病毒载体包装HBV基因组，可以有效的感染小鼠体内肝细胞。然而，该小鼠模型没有经过自然感染，且无法对小鼠肝细胞进行体内再感染，无法反映人体免疫系统的清除作用与HBV感染作用之间的关系。因此，对于构建HBV感染模型的作用有限[23-24]。此外，腺病毒感染本身在小鼠体内具有诱导免疫反应的作用，对实验结果会产生一定的影响[25-26]。

2 常见人鼠嵌合肝小鼠模型构建

人鼠嵌合肝小鼠模型是指利用同时具有免疫缺陷和肝细胞损伤死亡特性的小鼠模型，将其作为人类疾病体内研究的替代品，把人源肝细胞移植入小鼠的肝内而形成的嵌合体小鼠。由于小鼠体内整合有人肝细胞，因此研究者可以在动物水平模拟HBV对人肝细胞的感染作用并进一步开展机制的研究。对于人鼠嵌合肝小鼠模型的构建，有两点要求必须满足：①小鼠肝脏必须要进行诱导性损伤，从而为人源性肝细胞的植入创造良好的再生环境；②小鼠体内的免疫系统应当适应人源性肝细胞的存在，从而使其在小鼠体内可以长期生存。目前常见的人鼠嵌合肝小鼠模型主要有两种，一种是白蛋白启动子调控尿激酶纤维蛋白溶酶原活化子（albumin promoter/enhancer-regulated- urokinase plasminogen activator, Alb-uPA）小鼠为基础的人鼠嵌合肝模型，另外一种则是以延胡索酰乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase, Fah）敲除（Fah-/-）小鼠模型为基础的人鼠嵌合肝模型。

2.1 Alb-uPA小鼠为基础的人鼠嵌合肝模型 AlbuPA转基因小鼠模型是第一种被用于研究人鼠嵌合肝研究的小鼠基本模型，该小鼠携带uPA，并受Alb增强子/启动子调控。1995年，Rhim等[27]将该模型构建出来并用其来研究大鼠肝细胞的功能状态。通过小鼠Alb的启动子调控小鼠体内uPA的表达，使得该小鼠血浆中的尿激酶型血浆素原激活剂活动度增高，从而引起小鼠肝细胞的损伤，为后续移植入外源性肝细胞并促进其生长创造了条件。由于uPA转基因具有强烈促进外源性肝细胞再生的能力，研究人员将其与免疫缺陷鼠如重组体激活基因2（recombinant activation gene-2, Rag2）基因敲除（Rag2-/-）小鼠或重症联合免疫缺陷（severe combined immunode fi ciency, SCID)小鼠进行杂交，从而获得满足人鼠嵌合肝模型构建的小鼠模型。根据与uPA小鼠模型所杂交的免疫缺陷小鼠类型的不同，研究人员分别获得了uPA/ Rag2-/-小鼠和uPA/SCID小鼠。Rag2-/-小鼠无法正常表达Rag2，从而缺少正常的T、B淋巴细胞。将uPA小鼠与Rag2-/-小鼠杂交获得的uPA/Rag2-/-小鼠模型既具备肝细胞进行性死亡的特性，又处于免疫缺陷状态。该小鼠模型在2001年被首次应用于人鼠嵌合肝的构建并进行HBV感染研究。在移植入人源肝细胞的小鼠中被证实能表达人源白蛋白，且免疫组织化学等实验显示人源性肝细胞在小鼠肝细胞中的构成比可以高达15%，表明人肝细胞可以整合入该小鼠模型的肝脏中，且能保持细胞分裂与正常功能的维持[28]。

尽管人源性肝细胞可以在uPA/Rag2-/-小鼠体内生长繁殖，但是该模型仍然不能满足研究人员的需要。在2004年，Tateno等[29]首次将uPA小鼠与SCID小鼠杂交获得uPA/SCID小鼠模型，人源肝细胞移植入该小鼠模型的成功率可以高达92%，且小鼠中保留的人肝细胞保留有正常的药理反应，此外，人肝细胞对病变的小鼠肝组织进行了大规模的替换，并形成了具有功能的胆小管[30]。因此，该小鼠模型除了可以被应用于构建HBV感染模型外，还可以进一步研究HBV致病机制和抗HBV的药物。

2.2 Fah-/-小鼠模型为基础的人鼠嵌合肝模型 Fah-/-小鼠最初用于研究I型遗传性酪氨酸血症。Fah是酪氨酸分解代谢过程最后一步的关键酶，可将延胡索酰乙酰乙酸分解为延胡索酸和乙酰乙酸。其功能缺失可导致其上游底物马来酰乙酰乙酸和延胡索酰乙酰乙酸的蓄积，引起广泛的肝细胞坏死和肝损伤。2-硝基-4-三氟甲苯-1，3环乙垸碘（NTBC）可以抑制Fah上游4-对羟基苯丙酮酸双氧化酶的活性，减少毒性代谢产物的产生，虽然不能从根源上解决Fah基因缺失对肝的损伤，却可以有效维持Fah-/-小鼠的生存[31-32]。

Grompe等[31]发现，经脾注射野生型同种系小鼠肝细胞可在停用NTBC的Fah-/-小鼠肝脏内定植，恢复小鼠异常的肝功能。从此Fah-/-小鼠肝损伤模型在研究外源细胞在肝脏的定植状况中得到了广泛应用，与uPA诱导的肝损伤模型相比，Fah-/-肝损伤模型存在以下两方面优势：①小鼠的肝损伤程度和移植后的选择压力可通过在饮水中添加NTBC的方式予以调节，简化了小鼠的饲养与手术；②Fah-/-小鼠是基因片段（外显子5）的缺失导致的，而不是插入突变，不存在恢复到野生型的可能，因此可以在任何时间段进行移植。

Azuma等[33]率先应用裸鼠、NOD/SCID小鼠、Rag1-/-小鼠和Rag2-/-/Il-2rγ-/-小鼠与Fah-/-小鼠杂交，结果显示，Fah-/-裸鼠与Fah-/-/Rag1-/-小鼠均无法成功再植人源肝细胞，而Fah-/-/NOD/SCID小鼠虽有很低的移植成功率，但是大多数小鼠在停用NTBC后会迅速出现肝损伤并死亡。仅在Fah-/-Rag2-/-/Il2rg-/-（FRG）小鼠中人源肝细胞再植成功，移植成功率为10%～60%，但是在移植前须要采用表达uPA的腺病毒进行预处理。同年，Bissig等[34]于移植前采用甲磺酸萘莫司他和氯膦酸盐对FRG小鼠进行处理，分别抑制小鼠的补体系统和肝脏的Kupffer细胞后，在未经表达uPA的腺病毒预处理的情况下经脾脏移植人源肝细胞后，将移植成功率提高到45%～100%。

3 常见人鼠嵌合肝小鼠模型的应用

3.1 Alb-uPA小鼠模型的应用 HBV的致病过程涉及到复杂的体内反应，单纯使用细胞、小鼠模型不足以在体外实验中证明其具体的致病机制，因此，人鼠嵌合肝模型可以在体外模拟人体感染HBV的重要性不言而喻。通过在嵌合肝小鼠模型腹腔内接种感染HBV的血清或细胞，部分人源性肝细胞内部发现cccDNA，而后者随着时间的推移，使得小鼠体内其他人源性肝细胞也会被HBV所感染，并可以在外周血中的检测到稳定水平的HBV含量，最终完成构建HBV感染人源性肝细胞的动物模型[35]。此外，有研究者将整合有1.4倍长度HBV DNA的HepG2细胞注射入小鼠模型中，发现小鼠外周血中的HBV含量也会明显升高，因此利用该小鼠模型来模拟人体感染HBV的过程是切实可行的[36]。除了构建HBV感染模型，嵌合肝模型还可以帮助我们进一步明确不同HBV对于人体的影响。通过接种不同乙型肝炎患者的血清，可以在体外详细地研究HBV不同的亚型及自然突变，从而为HBV致病过程的研究提供更加可靠的数据[37-38]。利用该技术，研究人员分别研究了HBV不同片段的具体作用，发现HBeAg对于病毒的感染和复制并没有明显的作用，而HBx蛋白对于HBV的复制则是不可或缺的[36,39]。

近十年来在药物实验方面，Alb-uPA小鼠为基础的人鼠嵌合肝模型是验证抗HBV药物并探索其作用机制的一个重要的技术平台。研究人员利用该小鼠模型对部分抗HBV药物进行的检测，发现拉米夫定和聚乙二醇干扰素α可以显著减少小鼠外周血中的病毒水平[36,40]。同时，相关研究人员利用该模型验证不同类型的干扰素对HBV的抑制作用并不相同，其中干扰素α则可以通过抑制cccDNA的转录活性从而实现抗HBV作用[41-42]。除此之外，研究人员发现HBV在感染过程中，可以通过激活NK细胞依赖的自然免疫反应来引起肝细胞DNA的异常甲基化[43]。而在代谢研究方面，最近的一项研究证实，HBV通过与细胞受体结合，可以改变肝细胞对胆汁盐的吸收并影响胆汁酸代谢相关基因的表达[44]。此外，有研究者尝试将最新的miRNA微阵列检测（miRNA芯片）与该小鼠模型结合。将HBV感染者的肝细胞移植入该小鼠模型培育8周，随后对其进行高通量检测，研究者发现部分miRNA发挥抑制HBV复制的作用[45]。此外，尚有其他研究证实，miRNA93可以调控相应蛋白的表达水平，从而决定HBV诱导HCC产生的易感性[46]。相关结果的发现为我们将来结合人源嵌合肝动物模型与测序技术提供了新的思路。

3.2 Fah-/-小鼠模型的应用 Bissig等[47]将从感染D亚型HBV的黑猩猩血清中提取的HBV经尾静脉注射入FRG小鼠，发现小鼠嵌合肝组织中HBV cccDNA、HBV RNA和HBV DNA复制中间体的水平均呈稳步上升趋势，免疫组织化学染色实验显示，小鼠体内人源肝细胞均可稳定表达HBcAg。更重要的是，在人源化水平较低的小鼠（人ALB水平0.04～0.16 ng/ml）体内同样也可检测到HBV的复制，即很少量的肝细胞就可以支持HBV的复制。说明HBV可以在FRG嵌合人源肝组织中进行复制，而且其复制能力与小鼠肝脏人源嵌合程度无关。

Fah-/-小鼠模型广泛可控性肝损伤的特点除了应用于构建人鼠嵌合肝模型外，还可应用于“睡美人”转座子（sleeping beauty transposon, SB transposon）转基因小鼠的构建。“睡美人”转座子与病毒载体相比较具有明显优势，其结构简单，对外源基因的影响较小，对插入片段的长度限制较小，可随机将外源基因转移并整合入小鼠体细胞基因组中的AT位点[48-49]。利用SB转座系统可将HBV序列（如有致癌能力的preS、X片段）整合到小鼠肝脏染色体上，并稳定表达，即实现了HBV片段在体内高效的转座，解决了目前转基因动物制作领域存在的基因整合率低、表达效率低、随机整合、制作成本高等技术瓶颈问题[50-51]。将Fah基因与所要研究的HBV片段连入表达SB转座酶质粒，通过高压水尾静脉注射入Fah-/-小鼠体内后逐渐停用NTBC，得以存活下来的小鼠即为转入外源HBV片段的转基因小鼠，可以模拟HBV在体内整合入宿主DNA后的致癌效应。例如，Bard-Chapeau等[52]将HBV的S片段通过SB转座子转入Fah-/-小鼠肝内，发现了2881个基因在HCC发生过程中起到关键作用，其中42.5%与人HCC组织的基因改变相对应。Keng等[53]将HBV的X片段和已知的人抑癌基因一同通过SB转座系统导入Fah-/-小鼠，初步探索了HBx介导的β-caternin相关的致癌机制。

4 人鼠嵌合肝小鼠模型的改进

4.1 Alb-uPA小鼠模型的改进 为了达到更好的人肝细胞移植效果，有研究者分别尝试将SCID/ beige小鼠和NOG小鼠分别与Alb-uPA小鼠杂交，所获得的小鼠模型具有更好的研究条件，已用于证明研究干扰素α对HBV的作用机制等研究[54-56]。由于uPA基因过表达会在小鼠体内引起不可控的出血，须要在小鼠出生后1个月以内移植人肝细胞，保证小鼠的存活。该技术难度大，移植窗口期短，容易引发实验的失败。因此，有学者利用四环素诱导调控系统（Tet-on）和腺病毒转入uPA基因的方法实现了对uPA基因的调控性表达[57]。除此之外，有研究者将Alb-uPA转基因小鼠的启动子替换为主要尿蛋白（major urinary protein, MUP）的启动子，该Mup-Upa转基因小鼠的肝损伤出现时间更晚，从而延长了移植窗口期，提高了实验的成功率[58]。

4.2 Fah-/-小鼠模型的改进 FRG小鼠繁殖力有限，且在生长过程和手术移植过程中有很高的死亡率，无法应用于大规模研究。因此，有学者选取繁殖能力和手术耐受性均较强的Fah-/-/Rag2-/-小鼠，应用NK细胞抑制剂GM1和免疫抑制剂他克莫司（FK506），改善该小鼠对异种移植物的排斥，人源肝细胞移植成功率与FRG小鼠接近。与FRG小鼠相比，Fah-/-/Rag2-/-小鼠繁殖力强，生长过程中和手术后死亡率低，并且同样可以感染HBV，该方法具有良好的应用价值[59]。以往FRG小鼠须要通过Fah-/-小鼠和Rag2-/-/Il-2rg-/-小鼠杂交获得，须要进行多次杂交和回交，费时费力。近年来兴起的如锌指蛋白酶、CRISPR/Cas9等基因编辑技术因可以直接在体外受精获得的受精卵中进行基因编辑而受到广泛关注。Benjamin等[60]对NOD Rag1-/-IL2rg（NRG）小鼠的受精卵应用锌指蛋白酶敲除Fah基因5号外显子，得到的小鼠同Fah-/-小鼠与NRG小鼠杂交得到的FNRG小鼠相比，有着相同的人源肝细胞再植率，并且可以在一定程度上模拟HBV感染对抗病毒药物的反应。Lineberger等[61]应用CRISPR/Cas9技术，仅耗时16周就实现了NRG小鼠中Fah基因的敲除，相比于传统方法省时省力。

4.3 TK-NOG小鼠模型的构建 TK-NOG小鼠模型也是一种新型人鼠嵌合肝小鼠模型，其主要利用胸腺嘧啶激酶（thymidine kinase, TK）构建完成的模型与NOD/SCID基因缺陷小鼠杂交获得TKNOG小鼠。该模型可以使小鼠体内的人肝细胞发挥长达8个月之久的正常功能，成功地应用于各种研究药物代谢的遗传多样性方面[62-63]。通过比较TK-NOG小鼠和uPA-SCID小鼠发现，注射人HBV感染血清的TK-NOG和uPA-SCID小鼠均发生病毒血症，且恩替卡韦和干扰素治疗药物的效果在两个鼠标模型中都是相似的。因此，TK-NOG小鼠也可用于研究肝炎病毒病毒学和评估抗病毒药物[64]。TK-NOG小鼠存在以下3个主要的优势：①不须使用外源性药物，移植后的人源化肝组织及其功能可以长期保持稳定；②TK-NOG小鼠较稳定，未出现系统性的肝脏疾病、肾脏疾病、出血等问题；③人肝细胞在TK-NOG小鼠肝脏中重建后继续增加GCV的用量可以保证较高的移植成功率[63]。

4.4 具备人免疫系统的人源嵌合肝小鼠模型 上述3类小鼠模型中，仅能检测到HBV的复制，并无法检测到HBV导致的肝细胞炎症和坏死，其原因在于HBV本身不会破坏肝细胞，其导致的免疫反应才是HBV导致肝细胞炎症和坏死关键。以上3类小鼠模型缺乏能特异性识别HBV的免疫系统，因此无法模拟人体感染HBV后免疫反应对肝脏的影响。有学者提出同时移植人源肝细胞和造血干细胞，可以在小鼠体内模拟人体免疫系统的想法，但在构建人源肝/造血系统双移植小鼠时，会遇到2个关键问题：①同一个人的造血干细胞和肝细胞很难获取，而如果移植不同个体的造血干细胞和肝细胞，移植的免疫系统会排斥非同体肝细胞，由于人的肝脏在胚胎时期兼具造血功能，因此胎肝中同时存在的胎肝成纤维细胞和造血干细胞因为不会产生排异反应，是理想的供体细胞来源；②没有现成的两系统同时成功异种移植的受体小鼠模型，即最适合肝异种移植的小鼠模型不适合造血干细胞移植，人源造血干细胞移植的小鼠模型包括NOG、NSG（NOD/SCID/γC-/-/SzJ）和Rag2/IL-2Rγc双敲小鼠模型，而如将其与人源嵌合肝小鼠模型杂交，得到的多基因敲除小鼠繁殖力和生存力无法得到保证[65]。Gutti等[65]选取Alb-uPA/NOG小鼠，先后或同时移植同一胎肝来源的肝成纤维细胞和造血干细胞，结果显示异种移植的胎肝成纤维细胞在小鼠肝脏成功定植，但人源ALB和CK-18+细胞水平在移植10周后均开始下降，说明胎肝成纤维细胞可以在鼠肝定植但无法持续生长，而造血干细胞则可以稳定定植并生长。制瘤素M（oncostatin M, OSM）在肝细胞的分化过程中可以起到关键作用，Billerbeck等[66]发现小鼠OSM与人OSM之间没有交叉反应性，因此在移植后向小鼠血液直接注入人OSM或通过高压水尾静脉注射注入人OSM表达质粒，可以提高人源胎肝成纤维细胞生长的竞争力，适应小鼠肝脏微环境的能力更强，由此在RFG小鼠模型基础上成功构建了具有人免疫系统的人源嵌合肝小鼠模型，并且在该小鼠血中不仅可检测到人T细胞和人B细胞，还可检测到人NK细胞和人单核细胞（经典造血干细胞移植小鼠模型并不能产生这两种免疫细胞），且在HBV感染后NK细胞的数量会显著提升，说明该小鼠可能有更强的人细胞免疫功能，但该小鼠模型能够产生人NK细胞和人单核细胞的机制尚不清楚。

5 展 望

传统HBV动物模型的构建为研究HBV的生物学特性、病毒与宿主的相互作用、病毒致病机制和开发防治HBV的疫苗和药物等方面的问题提供了良好的基础。但不能否认的是，由于HBV的自身特性和动物模型在生理结构、功能结构和病理变化等方面存在的差异，传统的实验动物模型已经无法为我们后续的研究提供强有力的科学支撑，其实验结果不能准确地推导到人群之中。

人源嵌合肝小鼠模型的出现打破了这一僵局，通过在免疫缺陷小鼠体内植入人源肝细胞，研究者可以在动物水平有针对性的模拟HBV对人肝细胞的感染作用并进行进一步的机制研究，并为抗HBV药物的研发与评估打下基础。此外，干细胞在该小鼠模型中的应用同样展示出了光明的前景。已有研究者通过将人源干细胞嵌合入该小鼠模型，从而构建了HIV和HBV共同感染的小鼠研究模型，为后续的研究打开了新的思路[65]。现阶段人源化人鼠嵌合肝HBV感染模型现在面临的问题主要是制备过程复杂、技术要求高、实验周期较长。但是随着科学技术的发展，相信相应问题均会迎刃而解，且在已有研究的基础上，最终有希望应用于临床，发挥自身特有的优势，帮助HBV患者进行更加精确的个性化治疗。

[1] Zhang HW, Yin JH, Li YT, et al. Risk factors for acute hepatitis B and its progression to chronic hepatitis in Shanghai, China［J］. Gut, 2008, 57(12):1713-1720.

[2] Yin J, Li N, Han Y, et al. Effect of antiviral treatment with nucleotide/nucleoside analogs on postoperative prognosis of hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma: a two-stage longitudinal clinical study［J］. J Clin Oncol, 2013, 31(29):3647-3655.

[3] Xie J, Zhang Y, Zhang Q, et al. Interaction of signal transducer and activator of transcription 3 polymorphisms with hepatitis B virus mutations in hepatocellular carcinoma［J］. Hepatology, 2013, 57(6):2369-2377.

[4] 曹广文. “ 癌症进化发育假说”的提出及其对癌症特异性防治的作用［J］. 第二军医大学学报，2015，36(4):349-361.

[5] 王贵强，王福生，成军，等. 《慢性乙型肝炎防治指南》（2015更新版）［J］. 传染病信息，2015，28(6):321-340.

[6] 卢姗姗，徐东平，李进. HBV前S/S基因突变的研究进展［J］.传染病信息，2016，29(2):112-116.

[7] Thimme R, Wieland S, Steiger C, et al. CD8(+) T cells mediate viral clearance and disease pathogenesis during acute hepatitis B virus infection［J］. J Virol, 2003, 77(1):68-76.

[8] Barker LF, Chisari FV, McGrath PP, et al. Transmission of type B viral hepatitis to chimpanzees［J］. J Infect Dis, 1973, 127(6):648-662.

[9] Walter E, Keist R, Niederost B, et al. Hepatitis B virus infection of tupaia hepatocytes in vitro and in vivo［J］. Hepatology, 1996, 24(1):1-5.

[10] 杨悦，许智慧，刘妍，等. HBV动物模型研究进展［J］. 传染病信息，2016，29(4):236-241.

[11] Yan RQ, Su JJ, Huang DR, et al. Human hepatitis B virus and hepatocellular carcinoma. I. Experimental infection of tree shrews with hepatitis B virus［J］. J Cancer Res Clin Oncol, 1996, 122(5):283-288.

[12] Jacob JR, Sterczer A, Toshkov IA, et al. Integration of woodchuck hepatitis and N-myc rearrangement determine size and histologic grade of hepatic tumors［J］. Hepatology, 2004, 39(4):1008-1016.

[13] Kosinska AD, Liu J, Lu M, et al. Therapeutic vaccination and immunomodulation in the treatment of chronic hepatitis B: preclinical studies in the woodchuck［J］. Med Microbiol Immunol , 2015, 204(1):103-114.

[14] Reaiche GY, Le Mire MF, Mason WS, et al. The persistence in the liver of residual duck hepatitis B virus covalently closed circular DNA is not dependent upon new viral DNA synthesis［J］. Virology, 2010, 406(2):286-292.

[15] Cova L, Zoulim F. Duck hepatitis B virus model in the study of hepatitis B virus［J］. Methods Mol Med , 2004, 96:261-268.

[16] Babinet C, Farza H, Morello D, et al. Specific expression of hepatitis B surface antigen (HBsAg) in transgenic mice［J］. Science, 1985, 230(4730):1160-1163.

[17] Guidotti LG, Matzke B, Schaller H, et al. High-level hepatitis B virus replication in transgenic mice［J］. J Virol , 1995, 69(10):6158-6169.

[18] 丛丽媛，李爱民，吴庆军，等. 慢性乙型肝炎病毒感染者细胞免疫功能与血清HBV DNA的关系［J］. 传染病信息，2010 23(4):218-220.

[19] Kim CM, Koike K, Saito I, et al. HBx gene of hepatitis B virus induces liver cancer in transgenic mice［J］. Nature, 1991, 351(6324):317-320.

[20] Koike K, Moriya K, Iino S, et al. High-level expression of hepatitis B virus HBx gene and hepatocarcinogenesis in transgenic mice［J］. Hepatology, 1994, 19(4):810-819.

[21] Akbar SK, Onji M. Hepatitis B virus (HBV)-transgenic mice as an investigative tool to study immunopathology during HBV infection［J］. Int J Exp Pathol, 1998, 79(5):279-291.

[22] Liu F, Song Y, Liu D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA［J］. Gene Ther, 1999, 6(7):1258-1266.

[23] Huang LR, Wohlleber D, Reisinger F, et al. Intrahepatic myeloidcell aggregates enable local proliferation of CD8(+) T cells and successful immunotherapy against chronic viral liver infection［J］. Nat Immunol, 2013, 14(6):574-583.

[24] Yang D, Liu L, Zhu D, et al. A mouse model for HBV immunotolerance and immunotherapy［J］. Cell Mol Immunol, 2014, 11(1):71-78.

[25] Huang LR, Gabel YA, Graf S, et al. Transfer of HBV genomes using low doses of adenovirus vectors leads to persistent infection in immune competent mice［J］. Gastroenterology, 2012, 142(7):1447-1450.

[26] Hartman ZC, Kiang A, Everett RS, et al. Adenovirus infection triggers a rapid, MyD88-regulated transcriptome response critical to acute-phase and adaptive immune responses in vivo［J］. J Virol, 2007, 81(4):1796-1812.

[27] Rhim JA, Sandgren EP, Palmiter RD, et al. Complete reconstitution of mouse liver with xenogeneic hepatocytes［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995, 92(11):4942-4946.

[28] Dandri M, Burda MR, Torok E, et al. Repopulation of mouse liver with human hepatocytes and in vivo infection with hepatitis B virus［J］. Hepatology, 2001, 33(4):981-988.

[29] Tateno C, Yoshizane Y, Saito N, et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs［J］. Am J Pathol, 2004, 165(3):901-912.

[30] Meuleman P, Libbrecht L, De Vos R, et al. Morphological and biochemical characterization of a human liver in a uPA-SCID mouse chimera［J］. Hepatology, 2005, 41(4):847-856.

[31] Grompe M, al-Dhalimy M, Finegold M, et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice［J］. Genes Dev, 1993, 7(12A):2298-2307.

[32] Overturf K, Al-Dhalimy M, Tanguay R, et al. Hepatocytes corrected by gene therapy are selected in vivo in a murine model of hereditary tyrosinaemia type I［J］. Nat Genet, 1996, 12(3):266-273.

[33] Azuma H, Paulk N, Ranade A, et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-mice［J］. Nat Biotechnol, 2007, 25(8):903-910.

[34] Bissig KD, Le TT, Woods NB, et al. Repopulation of adult and neonatal mice with human hepatocytes: a chimeric animal model［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(51):20507-20511.

[35] Volz T, Allweiss L, Ben MM, et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus［J］. J Hepatol, 2013, 58(5):861-867.

[36] Tsuge M, Hiraga N, Takaishi H, et al. Infection of human hepatocyte chimeric mouse with genetically engineered hepatitis B virus［J］. Hepatology, 2005, 42(5):1046-1054.

[37] Tanaka Y, Sanchez LV, Sugiyama M, et al. Characteristics of hepatitis B virus genotype G coinfected with genotype H in chimeric mice carrying human hepatocytes［J］. Virology, 2008, 376(2):408-415.

[38] Sugiyama M, Tanaka Y, Kato T, et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens［J］. Hepatology, 2006, 44(4):915-924.

[39] Tsuge M, Hiraga N, Akiyama R, et al. HBx protein is indispensable for development of viraemia in human hepatocyte chimeric mice［J］. J Gen Virol, 2010, 91(Pt7):1854-1864.

[40] Allweiss L, Volz T, Lutgehetmann M, et al. Immune cell responses are not required to induce substantial hepatitis B virus antigen decline during pegylated interferon-alpha administration［J］. J Hepatol, 2014, 60(3):500-507.

[41] Belloni L, Allweiss L, Guerrieri F, et al. IFN-alpha inhibits HBV transcription and replication in cell culture and in humanized mice by targeting the epigenetic regulation of the nuclear cccDNA minichromosome［J］. J Clin Invest, 2012, 122(2):529-537.

[42] Nakagawa S, Hirata Y, Kameyama T, et al. Targeted induction of interferon-lambda in humanized chimeric mouse liver abrogates hepatotropic virus infection［J］. PLoS One, 2013, 8(3):e59611.

[43] Okamoto Y, Shinjo K, Shimizu Y, et al. Hepatitis virus infection affects DNA methylation in mice with humanized livers［J］. Gastroenterology, 2014, 146(2):562-572.

[44] Oehler N, Volz T, Bhadra OD, et al. Binding of hepatitis B virus to its cellular receptor alters the expression profile of genes of bile acid metabolism［J］. Hepatology, 2014, 60(5):1483-1493.

[45] Kohno T, Tsuge M, Murakami E, et al. Human microRNA hsamiR-1231 suppresses hepatitis B virus replication by targeting core mRNA［J］. J Viral Hepat, 2014, 21(9):e89-e97.

[46] Ohno M, Otsuka M, Kishikawa T, et al. Specific delivery of microRNA93 into HBV-replicating hepatocytes downregulates protein expression of liver cancer susceptible gene MICA［J］. Oncotarget, 2014, 5(14):5581-5590.

[47] Bissig KD, Wieland SF, Tran P, et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment［J］. J Clin Invest, 2010, 120(3):924-930.

[48] 杨富强，饶桂荣. 乙型肝炎治疗性疫苗研究进展［J］. 传染病信息，2015，28(2):65-69.

[49] Hou X, Du Y, Deng Y, et al. Sleeping Beauty transposon system for genetic etiological research and gene therapy of cancers［J］. Cancer Biol Ther, 2015, 16(1):8-16.

[50] Bissig KD, Wieland SF, Tran P, et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment［J］. J Clin Invest, 2010, 120(3):924-930.

[51] Chayama K, Hayes CN, Hiraga N, et al. Animal model for study of human hepatitis viruses［J］. J Gastroenterol Hepatol, 2011, 26(1):13-18.

[52] Bard-Chapeau EA, Nguyen AT, Rust AG, et al. Transposon mutagenesis identifies genes driving hepatocellular carcinoma in a chronic hepatitis B mouse model［J］. Nat Genet, 2014, 46(1):24-32.

[53] Keng VW, Tschida BR, Bell JB, et al. Modeling hepatitis B virus X-induced hepatocellular carcinoma in mice with the Sleeping Beauty transposon system［J］. Hepatology, 2011, 53(3):781-790.

[54] Lutgehetmann M, Bornscheuer T, Volz T, et al. Hepatitis B virus limits response of human hepatocytes to interferon-alpha in chimeric mice［J］. Gastroenterology, 2011, 140(7):2074-2083.

[55] Suemizu H, Hasegawa M, Kawai K, et al. Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 377(1):248-252.

[56] Gutti TL, Knibbe JS, Makarov E, et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice［J］. Am J Pathol, 2014, 184(1):101-109.

[57] Song X, Guo Y, Duo S, et al. A mouse model of inducible liver injury caused by tet-on regulated urokinase for studies of hepatocyte transplantation［J］. Am J Pathol, 2009, 175(5):1975-1983.

[58] Tesfaye A, Stift J, Maric D, et al. Chimeric mouse model for the infection of hepatitis B and C viruses［J］. PLoS One, 2013, 8(10):e77298.

[59] He Z, Zhang H, Zhang X, et al. Liver xeno-repopulation with human hepatocytes in Fah-/-Rag2-/-mice after pharmacological immunosuppression［J］. Am J Pathol, 2010, 177(3):1311-1319.

[60] Winer BY, Huang T, Low BE, et al. Recapitulation of treatment response patterns in a novel humanized mouse model for chronic hepatitis B virus infection［J］. Virology, 2017, 502:63-72.

[61] Li F, Cowley DO, Banner D, et al. Efficient genetic manipulation of the NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null mouse by combining in vitro fertilization and CRISPR/Cas9 technology［J］. Sci Rep, 2014, 4:5290.

[62] Hasegawa M, Kawai K, Mitsui T, et al. The reconstituted ´humanized liver´in TK-NOG mice is mature and functional［J］. Biochem Biophys Res Commun , 2011, 405(3):405-410.

[63] 任晓楠，周晓辉. 用于肝脏疾病研究的人源化小鼠模型概述［J］. 中国实验动物学报，2014，(05):95-99.

[64] Kosaka K, Hiraga N, Imamura M, et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 441(1):230-235.

[65] Gutti TL, Knibbe JS, Makarov E, et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice［J］. Am J Pathol , 2014, 184(1):101-109.

[66] Billerbeck E, Mommersteeg MC, Shlomai A, et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells［J］. J Hepatol , 2016, 65(2):334-343.

（2017-04-01收稿 2017-04-15修回）

（本文编辑 闫晶晶）

Establishment and application of human liver chimeric mouse models in HBV-induced pathogenesis

FU Zhong-xing, YANG Fan, WANG Ling, ZHANG Hong-wei*, CAO Guang-wen*
Fu Zhong-xing and YUNG Fan are the first authors who coutributed equally to the article Department of Epidemiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China.

Viral hepatitis, especially hepatitis B, has long been heavy burden of liver disease worldwide. However, due to its host spectrum exclusively being primates, HBV infection is hard to be replicated in animal models. Human liver chimeric mouse models are generated from immunodeficient and liver defected mice transplanted with human hepatocytes. Due to chimerism with human hepatocytes, the mouse models can be infected by HBV and liver disease models can be generated. The mechanism by which HBV causes liver diseases can be elucidated accordingly. The models are constructed mainly on the basis of Alb-uPA mouse model and Fah-/-mouse model. HBV can be detected both in the human chimeric liver tissue and peripheral blood of the models. The models have been applied for the investigation of HBV mutations, HBV gene functions, anti-HBV agent effects, the interactions between HBV and immune system. This article reviews the advantages and disadvantages of those HBV infection models and emphasizes the advances and improvement in human liver chimeric mouse models.

mouse models; hepatitis B virus; immunodeficiency mice; humanized mice; human liver chimeric mouse model

R-332；R373.21

A

1007-8134(2017)02-0075-07

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.02.003

国家重点基础研究发展计划（973计划）（2015CB554005，2015CB554006）；国家自然科学基金重大研究计划集成项目（91529305）；国家自然科学基金重点国际合作项目（81520108021）；国家自然科学基金面上项目（81673250）

200433 上海，第二军医大学流行病学教研室（傅忠星、杨帆、王灵、张宏伟、曹广文）前两位作者对本文有同等贡献，均为第一作者

张宏伟，E-mail: hwzhang@smmu.edu.cn; 曹广文，E-mail: gcao@smmu.edu.cn

*Corresponding author. ZHANG Hong-wei, E-mail: hwzhang@smmu.edu.cn; CAO Guang-wen, E-mail: gcao@smmu.edu.cn