周永春 陈云兰 黄云超

(昆明医科大学第三附属医院，云南 昆明 650000)

Sox4在女性肺癌细胞上皮-间质转化中的作用及其机制

周永春 陈云兰 黄云超

(昆明医科大学第三附属医院，云南 昆明 650000)

目的 探讨Sox4在女性肺癌细胞上皮-间质转化(EMT)中的作用及其机制。方法 76例行肺癌根治术的女性肺癌组织标本为观察组，49例癌旁肺组织标本为对照组，采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)和Western印迹法检测Sox4的表达水平；采用RNA干扰技术下调Sox4表达，利用脂质体2000向肺癌细胞系XWLC-05转染Sox4-siRNA，同时以未转染XWLC-05为对照，采用qPCR和Western印迹方法检测两组Sox4表达水平及内镜下黏膜切除术(EMR)上皮标记β-catenin、E-cadherin，间质标记Fibronectin、vimentin、N-cadherin的表达情况，采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氯唑溴盐(MTT)、Transwell及细胞划痕实验检测转染组与未转染组细胞增殖、侵袭、迁移能力。结果 观察组Sox4 mRNA水平及蛋白水平表达均明显高于对照组(P<0.05)；转染组Sox4 mRNA水平及蛋白水平表达均明显低于未转染组(P<0.05)；qPCR结果显示，转染组β-catenin、E-cadherin水平明显高于未转染组(P<0.05)，转染组Fibronectin、vimentin、N-cadherin水平明显低于未转染组(P<0.05)，Western印迹结果与qPCR检测结果相一致；MTT实验结果显示，转染Sox4-siRNA细胞后，XWLC-05细胞增殖能力与未转染组无明显差异(P>0.05)，Transwell实验结果显示，转染Sox4-siRNA细胞后，XWLC-05细胞侵袭、迁移能力较未转染组明显降低。结论 Sox4可能是通过下调β-catenin、E-cadherin表达及上调Fibronectin、vimentin、N-cadherin表达促进EMT发生，诱导人肺癌细胞发生侵袭转移。

Sox4；肺癌；上皮-间质转化(EMT)

目前，由于肺癌的发病机制尚未完全清楚，临床上仍然缺乏特异性治疗性药物，手术切除及放化疗是临床常用肺癌治疗手段，术后复发及癌细胞发生侵袭转移是导致临床肺癌死亡率急剧升高的主要原因〔1，2〕。上皮-间质转化(EMT)与肿瘤的发生发展密切相关，且在多种癌症侵袭及转移过程中发挥重要作用〔3〕。Sox4是Sox家族重要转录因子之一〔4〕，研究表明〔5〕，Sox4在肺癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤中表达异常，且受女性激素调节，与女性肿瘤的发生发展具有潜在关系，但其作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨Sox4在女性肺癌细胞EMT中的作用及机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2015年3月至2016年3月我院76例行肺癌根治术的女性肺癌组织标本为观察组，49例癌旁肺组织标本为对照组，年龄48～72岁，平均(56.34±4.27)岁。肺腺癌52例，鳞癌11例，其他13例；低分化39例，中分化23例，高分化14例；TNM分期Ⅰ期36例，Ⅱ期25例，Ⅲ期15例；淋巴结转移39例，淋巴结未转移37例，标本均采用液氮速冻，并保存于-80℃冰箱。本研究经本院伦理委员会批准，且临床标本采集符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 细胞系、试剂与仪器 人肺癌细胞系XWLC-05来自我院外科实验室。Trizol、DEPC、反转录试剂盒、SYBR PrimeScript qPCR Kit(TaKaRa公司，日本)，RT-PCR仪(ABI7700，美国ABI公司)，紫外分光光度计(Beckman公司，美国)，脂质体2000(Invitrogen公司，美国)，Sox4小干扰RNA(Sox4-siRNA)试剂盒(Ambion公司，美国)，Sox4、GAPDH引物(生工生物有限公司，上海)，Transwell小室(Corning公司，美国)，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)试剂盒(Sigma公司，美国)。

1.3 实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR) Trizol法分别提取肺组织总RNA，所提RNA经OD测定，OD260 nm/OD280 nm比值1.8～2.0，提示所提RNA为高纯度RNA，无蛋白质、DNA残留。28 s和18 s亮度比值基本符合2∶1，说明RNA完整性好，无降解。按照反转录试剂盒进行反转录。实时qPCR所用引物由上海生工合成，Sox4，正向CTTGACATGATTAGCTGGCATGATT；反向CCTGTGCAATATGCCGTGTAGA。GAPDH，正向CCAAAATCAGATGGGGCAATGCTGG；反向TGATGGCATGGAC-TGTGGTCATTCA。反应总体积10 μl：cDNA 1 μl，SYBR Primix Ex Taq TM 5 μl，引物0.4 μl，RNase H2O 10 μl。反应条件为：95℃预变性5 min，95℃ 15 s，60℃ 20 s，70℃ 30 s进行30个循环。以GAPDH为内参，每个样品均设3个复孔，结果采用2-ΔΔCT方法处理，其中ΔΔCT=(CTSox4-CTGAPDH)观察组-(CTSox4-CTGAPDH)对照组。

1.4 蛋白质印迹法 采用Western印迹方法检测Sox4蛋白水平表达量，提取细胞总蛋白及蛋白定量，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，严格按照操作步骤进行。

1.5 细胞转染 采用RNA干扰技术下调Sox4表达，利用脂质体2000向肺癌细胞系XWLC-05转染Sox4-siRNA，同时以未转染XWLC-05为对照，XWLC-05细胞消化并计数，取1×105/ml个肝癌细胞接种于制备好的平板上，过夜培养，镜下观察细胞密度达40%时即可进行转染。操作严格按照试剂操作说明书。

1.6 MTT实验 采用MTT实验检测转染后XWLC-05肺癌细胞增殖能力，具体操作严格按照试剂盒说明书，采用酶联免疫分析仪，于波长490 nm处测定样本吸光度，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制生长曲线。

1.7 Transwell实验 转染XWLC-05细胞培养48 h后消化并计数，取2×105/ml细胞置于已灭菌1.5 ml Eppendorf管中，滴加200 μl空白培养基重悬细胞，按照Transwell小室试剂盒说明严格操作(侵袭实验Transwell小室需铺Matrigel胶，迁移实验则不需要)，固定染色后，200倍显微镜下，每个样本随机选取5个视野计数。

1.8 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行t、χ2检验。

2 结 果

2.1 观察组与对照组中Sox 4表达水平比较 观察组Sox4 mRNA水平(2.64±0.32)明显高于对照组(1.31±0.16，P<0.05)，Western印迹结果亦相同。见图1。

2.2 转染后XWLC-05细胞中Sox4表达水平 转染组Sox4 mRNA水平(0.19±0.03)明显低于未转染组(1.37±0.14)(P<0.05)，Western印迹结果亦一致。见图2。

图1 两组Sox4相对表达情况

图2 转染后Sox4表达情况

2.3 Sox4诱导XWLC-05细胞发生EMT 见图3。转染组β-catenin、E-cadherin水平(2.06±0.22、1.56±0.17)明显高于未转染组(0.53±0.08、0.42±0.06，P<0.05)，转染组Fibronectin(1.13±0.10)、vimentin(1.34±0.09)、N-cadherin水平(1.08±0.07)明显低于未转染组(4.26±0.30、2.58±0.27、3.72±0.24，P<0.05)，Western印迹结果亦一致。

图3 两组EMT相关基因在XWLC-05细胞中表达情况

2.4 Sox4表达水平对XWLC-05细胞增殖能力影响 转染Sox4-siRNA细胞后，XWLC-05细胞增殖能力与未转染组无明显差异(P>0.05)。见图4。

图4 转染Sox4-siRNA细胞后XWLC-05细胞增殖情况

2.5 Sox4表达水平对XWLC-05细胞侵袭、迁移能力影响 转染Sox4-siRNA后，转染组XWLC-05细胞侵袭穿膜细胞数〔(92.03±11.56)个〕明显少于未转染组〔(343.71±29.46)个〕，转染组XWLC-05细胞迁移距离〔(58.37±5.28)nin〕明显短于未转染组〔(90.65±9.47)nin〕(均P<0.05)。见图5，图6。

图5 转染Sox4-siRNA后XWLC-05细胞侵袭情况(×200)

图6 转染Sox4-siRNA后XWLC-05细胞迁移情况(×100)

3 讨 论

控烟运动的开展使男性肺癌发病率及死亡率有所下降，但女性肺癌发病率呈现增长趋势〔6〕。手术是治疗肺癌的首选方法，但大多数肺癌患者往往因肺癌细胞侵袭及转移而丧失手术治疗机会，此时临床常选择放化疗进行治疗。放化疗在取得良好疗效的同时，也给病人带来了极大的痛苦及不良反应〔7〕。因此，寻找及开发高效、特异的治疗靶点对于临床治疗肺癌意义重大〔8,9〕。EMT是上皮细胞通过特定的细胞程序转变为间充质细胞的生物学过程，通过高度保守的程序使上皮细胞失去诸如细胞极性、细胞黏附及下调β-catenin、E-cadherin上皮细胞标记物，从而获得迁移、侵袭、抗凋亡能力、细胞骨架重组及上调间质标记物Fibronectin、vimentin、N-cadherin等间充质细胞特性〔10〕。大量研究证实〔11〕，EMT能够促进癌细胞的侵袭及转移。Sox4属于SOX家族C亚族基因，定位于人类Y染色体上6p22.3，在基因调控中起转录因子作用〔12〕，多项研究表明，Sox4在乳腺癌〔13〕、肺癌〔14〕、结肠癌〔15〕等多种恶性肿瘤中表达异常，与肿瘤的发生发展密切相关。因此，Sox4可能是恶性肿瘤的一个潜在治疗靶点。

本研究提示Sox4参与肺癌发生发展；Sox4-siRNA转染肺癌XWLC-05细胞，转染成功，可用于后续试验研究。EMT相关基因实时qPCR检测结果提示Sox4诱导肺癌XWLC-05细胞发生EMT过程，且下调Sox4可明显抑制EMT过程发生；通过MTT细胞增殖实验，Transwell细胞侵袭、迁移实验进一步验证下调Sox4对EMT过程调节所导致XWLC-05细胞增殖、侵袭、迁移变化，MTT实验结果提示下调Sox4对XWLC-05细胞增殖无明显影响；Transwell实验结果提示下调Sox4可使XWLC-05细胞的侵袭、迁移能力明显降低，即抑制Sox4表达可降低肺癌细胞的侵袭及迁移。

综上，Sox4可能是通过下调β-catenin、E-cadherin表达及上调Fibronectin、vimentin、N-cadherin表达促进EMT发生，诱导人肺癌细胞发生侵袭转移。

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3 张秀红,杨增明.上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)在癌症转移、胚胎发育及哺乳动物雌性生殖过程中的作用机制〔J〕.生物化学与生物物理进展,2012;39(4):307-13.

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9 王 帅.非小细胞肺癌分子标志物的临床意义及靶向治疗相关研究〔D〕.北京：北京协和医学院,2014.

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14 金 颖.MicroRNA-338-3p通过介导SOX4发挥乳腺癌的抑制作用研究〔D〕.长春：吉林大学,2016.

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〔2016-03-13修回〕

(编辑 苑云杰)

The function and mechanism of Sox4 in the epithelial mesenchymaltransition of human lung cancer cells

ZHOU Yong-Chun,CHEN Yun-Lan,HUANG Yun-Chao.

The Third Affiliated Hospital,Kunming Medical University,Kunming 650000,Yunnan,China

Objective To investigate the function and mechanism of Sox4 in the epithelial mesenchy maltransition of human lung cancer cells.Methods 76 cases of female lung cancer tissue were selected as observation group,and 49 cases of cancerous lung tissue as control group. The expression level of two groups were observed by real time-qPCR and Western blot. RNA interference technology was used to detect down-regulation of expression of Sox4 by liposome to 2000 female lung cancer cell line XWLC-05 transfected with Sox4-siRNA,and the non transfected XWLC-05 as the control,qPCR and Western blot method were used to detect the expression level of Sox4 in two groups,and the epithelial marker EMR β-catenin,E-cadherin,expression of mesenchymal markers Fibronectin,vimentin,N-cadherin. The proliferation,invasion and migration ability of the transfected and non transfected cells were detected by MTT,Transwell and cell scratch test. Results Sox4 and protein levels of mRNA expression of observation group were significantly higher than those of control group (P<0.05);Sox4 mRNA and protein levels of expression of transfection group were significantly lower than those of non transfection group (P<0.05);qPCR results showed that P-catenin,E-cadherin levels of transfection group were significantly higher than those without transfection group (P<0.05).N-cadherin levels of fibronectin,vimentin,transfection group were significantly lower than those of non transfection group (P<0.05),Western blot and qPCR detection results were consistent;the results of MTT showed that the transfected Sox4-siRNA cell,XWLC-05 cell proliferation was not significantly different from that of non transfection group (P>0.05) Transwell,the experimental results showed that after transfection into Sox4-siRNA cells,XWLC-05 cell invasion and migration ability was significantly lower in non transfection group. Conclusions Sox4 may be through downregulation of beta E-cadherin,β-catenin expression and up regulation of Fibronectin,vimentin,N-cadherin expression to promote the occurrence of epithelial mesenchymal transition,induce the invasion and metastasis of human lung cancer cells.

Sox4;Lung cancer;Epithelial mesenchymal transition

国家自然科学基金地区基金(No.81460441)；云南省教育厅科研基金重点项目(No.2013Z110)；云南省科技厅-昆明医科大学联合专项基金项目(No.2013FB132)

黄云超(1962-)，女，博士，主任医师，主要从事肺癌研究。

周永春(1976-)，女，博士，副主任医师，主要从事肺癌研究。

R735

A

1005-9202(2017)04-0794-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.006