常秋燕，周小凯，马 鹏，马晓霞，冯玉萍*

(1.西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州，730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州，730030)



病毒感染激活TLRs和RLRs介导的IFN信号通路研究进展

常秋燕1,2，周小凯1,2，马 鹏1,2，马晓霞1,2，冯玉萍1,2*

(1.西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州，730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州，730030)

在病毒侵染机体的过程中，机体的多数组织器官可以高效产生干扰素。近些年的研究发现，能够有效识别病毒侵染机体过程中的相关模式分子(例如病毒复制中间产物双链RNA)的细胞受体是产生干扰素的主要感受器，这些细胞受体(例如Toll样受体和RIG-Ⅰ样受体)能够诱发一系列的信号级联反应，并且被激活的感受器可以启动干扰素相关基因的转录活性，从而产生特定的干扰素。值得注意的是，不同种类的病毒能够倾向性地去激活特定的细胞感受器，并且产生特定的信号转导通路。论文主要从Toll样受体和RIG-Ⅰ样受体的结构入手，讨论宿主细胞模式受体在干扰素抗病毒过程中行使的功能，并简单介绍干扰素在抗病毒过程中的信号级联反应。

RNA病毒；干扰素；感受器；Toll样受体；RIG-Ⅰ样受体；信号通路

科研人员在研究病毒感染动物机体的过程中发现[1]，无论是DNA病毒还是RNA病毒在感染宿主细胞后，在其胞质里转录复制的过程中可以产生一种RNA双链的复制中间产物，而这种中间产物具有极强的刺激机体产生抗病毒因子的能力。这种抗病毒因子为干扰素，具有对机体免疫调节的作用，同时也可以与周围未感染的细胞互作，从而使未感染病毒的细胞通过信号转导过程使其自身具有抗病毒活性[2]。除了一些没有分化的胚胎癌细胞以外，大多数原代细胞或者传代的上皮细胞和成纤维细胞在病毒感染后都可以产生干扰素[3]。在对缺失Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)的细胞株感染病毒后的生物学变化研究过程中，发现缺失TLRs受体的细胞可以正常产生干扰素来抗击病毒的侵染，由此推测干扰素的产生与否可能与细胞内是否存在一种探知病毒存在的特殊感受器有关，并且在一定程度上，干扰素的产生也对病毒的增殖是必要的。利用蛋白组学的研究手段，研究人员发现有一类受体家族成员(包括RIG-Ⅰ、MDA5及LGP2)具有RNA解旋酶活性，可以有效将双链RNA等病毒中间产物进行解旋，并且将解旋的RNA提供给特定的细胞受体来刺激干扰素相关基因的表达[4]。这一受体家族被称为RIG-Ⅰ样受体(RIG-Ⅰ like receptors,RLRs)家族，并且这一家族成员在结构上都具有DExD/H解旋酶结构域和一个碳末端结构域[5]。而RLRs家族[6]是如何识别病毒侵染宿主细胞后所产生的中间产物呢？本文将从TLRs和RLRs的结构入手来阐述结构如何决定生物学功能，进而产生宏观的生物学效应及干扰素的抗病毒效应。

1 TLRs与干扰素的产生

TLRs[7]不仅存在于细胞膜表面，而且可以作为一种细胞内模式受体来行使重要的生物学功能，其具有识别位于细胞表面或核内存在的细菌或病毒的相关分子模式[8]。在TLRs家族中，Toll样受体7与Toll样受体8均可识别具有多聚尿嘧啶链(ploy-(rU))的单分子RNA，并且可以通过多种信号通路激活干扰素刺激基因的表达，从而诱导干扰素的产生[9]。Toll样受体9具有识别未甲基化的DNA链中的特定核苷酸组成模式基序，这个模式基序是由胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)构成的特定核苷酸二聚体链，这种模式在很多RNA病毒(例如流感病毒、口蹄疫病毒及猪瘟病毒等)中都存在，这都是Toll样受体识别的病毒相关分子模式[10]。Toll样受体7、8、9存在于浆样树突状细胞(plasmacytoid dentric cells，pDCs)内，这些细胞在接触RNA病毒于细胞内产生的特定RNA链所携带的相关分子模式后进而激活干扰素基因，诱导产生干扰素起到抗病毒作用。与Toll样受体7、8、9相比较，Toll样受体3所识别的病毒相关模式为包含poly-rI: poly-rC (poly-I:C)在内的双链RNA，并且Toll样受体3使细胞具有特异性，可以通过将具有内吞能力的内吞小泡的pH降为5.5来内吞摄取胞外病毒中间产物(dsRNA)，从而激活干扰素基因的转录产生干扰素。利用蛋白质解析技术，通过分析TLR-3/dsRNA复合物的三级结构[11]，发现Toll样受体3需要构成同源二聚体才能对细胞内吞摄取的dsRNA分子进行有效识别，其过程是Toll样受体3识别dsRNA分子后，细胞内的Toll样白介素受体1(Toll-IL-1 receptors，TIR)活化，从而招募信号分子TRIF/TICAM1、TRAF3及TRAF6形成信号通路，并且使效应蛋白酶活化进而激活干扰素转录因子，产生干扰素。

2 RLRs与干扰素的产生

2.1 RLRs的特异性

研究人员利用基因敲除技术将RLRs[12]基因沉默，发现缺失RLRs表达的细胞对大多数病毒不具有抗病毒活性，虽然缺失RLRs不会影响小RNA病毒在细胞内的复制，但是RLRs家族中的黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation associated gene 5，MDA5)在抗病毒方面起到了很重要的作用。视黄酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid-induced gene I，RIG-Ⅰ)和MDA5分子具有识别包括西尼罗病毒在内的RNA病毒侵染靶细胞的能力。在细胞培养中，超表达RLRs家族中的LGP2(laboratory of genetics and physiology 2)分子可以有效诱导干扰素的产生，从而使细胞具有抗病毒能力。值得注意的是，一些RNA病毒(鼠脑心肌炎病毒、水疱性口炎病毒及新城疫病毒)在侵染缺失LGP2分子的小鼠后，小鼠无法产生干扰素，但是流感病毒却可以在LGP2不存在的情况下使缺陷型小鼠产生干扰素[13]，这说明LGP2对所侵染机体的病毒类型是有所选择的，这在一定程度上反映出RLRs家族在识别不同病毒侵染细胞中具有偏嗜性。

2.2 RLRs家族对病毒RNA的识别

对于RLRs[14]家族的特定成员来说，它们对不同种类的病毒有着不同的识别倾向性。例如RIG-Ⅰ分子[15]和MDA5分子对不同病毒的识别存在差异，其部分原因是由于不同类型的RNA病毒产物对RLRs家族成员具有敏感偏嗜性，例如ploy-I:C产物只能够激活MDA5分子，但是对RIG-Ⅰ分子不敏感，但是由T7聚合酶体外转录的RNA通过退火互补结合所产生的dsRNA则明显倾向于激活RIG-Ⅰ分子[16]。通过进一步分析，研究人员发现，dsRNA病毒产物的长度是决定RNA分子可以倾向选择激活何种RLRs家族成员的重要因素，例如300 bp的poly-I:C 可倾向激活RIG-I分子,而大于4 000 bp的长poly-I:C 则可激活MDA5分子的活性。此前有报道指出具有5′三磷酸的单链RNA也可以激活RIG-Ⅰ分子的活性，并且将具有5′三磷酸单链的RNA定义为RIG-Ⅰ分子的专有配基，然而进一步分析发现，噬菌体聚合酶所具有的逆转录活性造成5′三磷酸单链RNA局部可以形成双链结构，从而激活RIG-Ⅰ分子的活性。通过此项发现，研究人员进一步确定了这类双链RNA的天然存在形式，那就是一些RNA病毒5′UTR内部形成的发卡结构，例如流感病毒、仙台病及丙型肝炎病毒等，都可以激活RIG-Ⅰ分子的活性。在激活RIG-Ⅰ分子活性的过程中，dsRNA的5′端必须磷酸化，并且宿主RNA酶L将单链RNA部分从形成部分双链RNA结构的RNA链中剔除，而后以dsRNA的形式作为激活RIG-Ⅰ分子的配基。在研究一些RNA病毒和DNA病毒如何激活MDA5分子活性的过程中，研究人员发现脑心肌炎病毒与牛痘病毒产生的长链RNA可以以单链RNA和双链RNA混合体的形式存在，并且这种RNA复合物可高效激活MDA5分子。但是这种RNA复合物是如何激活MDA5分子的分子机制尚未阐明，但是根据RNA激活RIG-Ⅰ分子活性的分子机理来看，这种含有双链RNA结构的长链RNA可能也是通过其所具有的双链结构来影响MDA5[17]分子活化的。

2.3 RLRs家族识别RNA的结构基础

在RLRs家族成员中，RIG-Ⅰ分子和LGP2分子的RNA识别结构域对形成双链RNA的RNA片段的亲和力很强，但是MDA5分子对双链RNA的亲和性明显低于前两者。通过蛋白质结构分析技术研究RLRs家族成员的蛋白质二级结构发现，RIG-Ⅰ、MDA5、LGP2这3种家族成员的二级结构很相似，但是在三级结构的水平上来看，其结构差异很明显。对于RIG-Ⅰ分子和LGP2分子蛋白结构中对应的特异性识别双链RNA分子的结构进行分析，发现结构域中存在一个由碱性氨基酸残基构成的带有正电荷的裂隙结构。利用核磁共振滴定法来研究双链RNA与这个携带有正电荷的裂隙结构的关系时发现，双链RNA可以以嵌合体的形式与这个裂隙结构结合从而发生互作。在研究MDA5分子的过程中，这个由碱性氨基酸构成的正电荷裂隙结构更长，这也可以从侧面说明MDA5分子激活可能需要由大分子的双链RNA来进行互作刺激，从而激活相关免疫信号通路。那双链RNA是如何与这个正电荷裂隙结构相互作用呢？结合在硅晶片上的双链RNA与RIG-Ⅰ分子中的正电荷裂隙结构的对接试验表明这个裂隙结构中有一个茎环结构上具有赖氨酸和苯丙氨酸残基，是与双链RNA结合的关键残基。分析LGP2分子的结构，发现苯丙氨酸是保守的，但是在MDA5分子上对应的区域只存在半胱氨酸残基，这可能说明MDA5分子在与双链RNA互作的分子机制与RIG-Ⅰ和LGP2[18]分子的不同。

3 RLRs家族启动抗病毒的信号机制

RLRs家族成员都具有RNA解旋酶活性，因为在相应蛋白分子结构域中含有一个RNA解旋酶结构域[19]。体外试验证明，重组RIG-Ⅰ通过其3′端突出结构来催化双链RNA发生解旋作用，但是与5′突出结构或者冗长末端的双链RNA在诱导干扰素产生的能力方面相比较，3′端突出结构对双链RNA的解旋反应不能有效刺激干扰素的产生[20-21]。这可能是因为RIG-Ⅰ分子的 3′端突出结构对双链RNA的自解旋活性不是为了刺激干扰素产生。在正常情况下，过量表达RIG-Ⅰ分子的半胱天冬酶活化结构域与招募结构域暴露，从而激活干扰素相关信号通路。由此推测，完整的RIG-Ⅰ分子通过其自身的抑制结构域、半胱天冬酶活化与招募结构域(caspase activation and recruitment domain, CARD)和解旋酶连接域分子间的相互作用而形成一个闭合结构，这种自发的抑制状态可以通过与配基RNA结合来诱导其构象改变而活化。而后活化状态的RIG-Ⅰ对应的解旋酶活化结构域与ATP互作发生水解反应。然而，尚不清楚其由此发生的下游信号通路对应的生理学意义，需要进一步探索研究。

4 干扰素产生的信号级联反应

病毒感染细胞产生的RNA中间体产物出现后，RLRs家族中的RIG-Ⅰ分子中的CARD结构域就被暴露出来，与此同时一种位于线粒体外膜且具有激活重要信号通路的蛋白IPS-1通过其自身具有的CARD结构域来与RIG-Ⅰ分子对应的CARD结构域互作，最终激发产生干扰素的级联反应信号。

4.1 肿瘤坏死因子与信号级联反应

研究显示，肿瘤坏死因子受体相关因子(tumour necrosis factor receptor- associated factor，TRAF)[22]家族成员可参与干扰素产生的相关信号级联过程。已知TRAF3是通过自身第63位残基上的赖氨酸与具有泛素化作用的E3连接酶发生作用，同时，TRAF3可直接与IPS-1分子中的脯氨酸富集区含有的与TRAF结合基序(TRAF-interacting motif，TIM) 发生直接作用，由此引发干扰素表达的信号级联反应。TRAF3之所以可以对由病毒感染的细胞进行有效杀伤，其原因在于病毒感染细胞后激活了由TRAF3参与的干扰素产生信号级联反应，最终导致受感染细胞自身的死亡。类似的生理学现象也发生在IPS-1与TRAF2或者TRAF6之间发生的相互作用。与IPS-1结合的TRAF家族成员可将分子信号传递到下游的蛋白激酶NF-κB激酶抑制子(inhibitor of NF-κB kinase，IKK)，再由IKK将分子信号传递于转录因子IRF-3和IRF-7，活化的IRF3和IRF7激活NF-κB的表达。典型的IKK复合物由IKK-α、IKK-β和IKK-γ组成，该复合物可磷酸化NF-κB抑制子(IκB)，随后，IκB的蛋白酶体依赖性降解可将功能化的NF-κB转运到细胞核，结合于IFN(interferon)或者干扰素刺激基因(interferon-stimulating genes，ISGs)启动子区的干扰素刺激应答元件(interferon stimulation response element，ISRE)上，与转录因子NF-κB，激活蛋白1(activator protein 1，AP1)一起诱导干扰素等靶基因的表达,此外，激活IKK途径的另外一种方式是与TRAF家族成员相关的NF-κB结合的激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)和IKK-i分子相互作用可使IRF-3和IRF-7磷酸化。由此可见，IPS-1分子和TRAF3分子发生互作是活化NF-κB的重要步骤。研究证实活化的IPS-1分子复合物C端结构域与凋亡相关的死亡受体也可以发生互作，进而与活化的半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10发生相互作用来激活NF-κB。此外，TNFR相关死亡结构域(TNFR-associated DD，TRADD)可与IPS-1分子、 TRAF3、TANK、凋亡相关死亡受体结构域形成复合物，从而活化干扰素调节因子3 (interforn regulatory factor 3, IRF-3)与NF-κB[23]。上述发现与肿瘤坏死因子受体介导的信号转导紧密相关，可形成类似的信号转导复合物。然而，目前还不清楚为什么是由IPS-1组成的复合物来激活IRF-3，而不是由TNFR介导的信号转导来激活IRF-3。这可能是由于IPS-1分子前体在线粒体上的定位会招募不同的信号复合物，在招募过程中一些与IRF-3活化相关的信号分子被激活，从而间接使IRF-3活化。

4.2 E3泛素化连接酶与信号级联反应

三基序蛋白25(tripartite motif protein 25, TRIM25)[24]是一种E3泛素化连接酶，可与RIG-Ⅰ分子的CARD结构域发生特异性互作，并且可在RIG-Ⅰ分子的CARD结构域的第172位赖氨酸残基处与TRAF3分子的CARD结构域第63位赖氨酸初发生相关的泛素化连接反应[25]。有趣的是，虽然TRIM25分子可有效使RIG-Ⅰ和LGP2分子的泛素化，但是TRIM25不能诱导MDA5分子发生泛素化。与此相反，E3连接酶中特定的RNF125结构域所引起的RIG-Ⅰ泛素化可产生相反的信号效应 ，从而实现对RIG-Ⅰ分子介导的信号转导进行负调控。去泛素化酶A(de-ubiquitinating enzyme A, DUBA)[26]是一个含有卵巢肿瘤结构域的酶，它可直接与TRAF3发生相互作用，催化TRAF3分子中第63位赖氨酸与E3泛素化连接酶解离。通过去泛素化酶A的去泛素化作用诱导TBK1从TRAF3上分离出来，从而屏蔽RLRs家族成员所介导的与干扰素发生的相关信号转导。此外，一种被命名为A20的蛋白酶是另一个含有卵巢肿瘤结构域的去泛素化酶，其主要参与NF-κB的激活，研究显示A20蛋白酶在RIG-Ⅰ样受体家族成员介导的信号转导中发挥负调节效应，这是由于A20蛋白酶抑制活性发挥关键作用的是其C端的泛素连接酶结构域，而非N端的去泛素化结构域。肿瘤抑制因子Cylindromatosis(CYLD)是另一种含有卵巢肿瘤结构域的去泛素化酶，同时也是RIG-Ⅰ介导的信号转导过程的负调节因子，CYLD能与RIG-Ⅰ或IPS-1发生物理层面上的相互作用，并且通过RIG-1分子中第63位赖氨酸连接参与解离E3泛素化连接酶的灭活基团来进行信号负调控。

总之，尽管目前研究报道认为IRG-Ⅰ样受体家族成员及其相关信号分子通过翻译后修饰，可以作为正调解因子和负调节因子，但是其精确的机制还有待于进一步阐明。

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Progress on IFN Signaling Pathways Mediated by Virus Infection Activated TLRs and RLRs

CHANG Qiu-yan1，2,ZHOU Xiao-kai1，2,MA Peng1，2,MA Xiao-xia1，2,FENG Yu-ping1，2

(1.GansuEngineeringResearchCenterForAnimalCell,NorthwestMinzuUniversity,Lanzhou,Gansu,730030,China; 2.2.CollegeofLifeSciencesandEngineering,NorthwestMinzuUniversity,Lanzhou,Gansu,730030,China)

During the course of infection by viruses,the protein,namely interferon (IFN),can be efficiently generated by various tissues and organs of host.Recently,many studies focused on how the middle products (i.e double strand RNA from virus’ replication) stimulate sensors which are cell surface receptors(such as Toll-like receptors and RIG-Ⅰ like receptors ),inducing a series of signal cascades and initiating the transcription of interferon-related genes in order to generate IFN.Of note,the specific type of virus have a strong tendency to initiate the specific cell’s sensors and generate the specific signal pathway.In this article,the process of antiviral function was discussed,and the interferon signaling cascade in the process of antiviral response was introduced from the structure of Toll-like receptors and RIG-Ⅰ like receptors of host cell receptors .

RNA virus; interferon; sensor; Toll-like receptor; RIG-Ⅰ like receptor; signal pathway

2016-12-30

西北民族大学研究生科研创新项目(Yxm2016138);国家民委专项(1001860564);甘肃省自然科学基金项目(145RJYA286)

常秋燕(1991-)，女，河北衡水人，硕士研究生，主要从事病原生物学与动物疫病防治研究。*通讯作者

S852.4

A

1007-5038(2017)07-0087-05