罗铭花 青海省湟源县畜牧兽医站812100

对一例顽固性奶牛乳房炎病原菌的分析

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奶牛乳房炎是奶牛养殖中最常见的一种乳腺疾病，发病率高，危害严重，是造成奶牛业经济损失的四大疾病之一。奶牛乳房炎的病因很多，但与养殖环境中的病原微生物的侵入有直接的关系，研究发现，奶牛乳腺炎主要是由链球菌、葡萄球菌和大肠杆菌等条件性致病菌引起的。此外气候变更、外力及遗传因素等都对乳房炎的诱发有一定的影响，如寒冷阴湿的季节发生率较高。

本研究对2016年5月本地区某规模化荷斯坦奶牛场的患乳房炎的奶牛经治疗后仍未痊愈的病例的鲜奶样品中的病原菌进行了分离和鉴定，以期了解顽固性病牛的病原菌感染情况，为寻找有效的治疗及控制奶牛乳房炎的方法提供科学依据。

1 材料与方法

（1）材料。采自当地某奶牛场患乳房炎、有临床症状且已经局部和全身用药但体温仍偏高、泌乳量明显少的泌乳奶牛，同时收集健康乳区乳样进行对照。

（2）主要试剂与仪器。麦康凯培养基、含4%牛血清及0.1%裂解血的培养基、选择培养基（包括7.5%甘露醇NaCl琼脂、S.S.琼脂、伊红美兰琼脂等）、PCR Mix、16S通用引物、生化反应管、电热恒温培养箱、DYY-6C型电泳仪、PCR仪及凝胶成像仪等。

（3）乳样的采集及处理。采集乳样前应先将乳区及操作人员手部彻底消毒后，弃去前面流出的乳汁，然后在无菌乳区采集50mL左右的鲜乳置于无菌的离心管中并做好标记，低温保存并快速送至实验室进行相关试验。

（4）乳样细菌培养。无菌环境下将病牛和健康牛的乳样分别涂在麦康凯培养基、含4%牛血清及0.1%裂解血的培养基及各种选择培养基上后，将各培养基置于37℃电热恒温培养箱中培养24小时，观察各培养基表面细菌的生长情况。

（5）菌落PCR鉴定及生化反应试验。将含有4%牛血清及0.1%裂解血的培养基及各种选择培养基上的菌落溶解于无菌的生理盐水中，煮沸10分钟后，应用16S通用引物进行PCR扩增，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳。鉴定结果显示，扩增的目的片段与预期的大小一致。将其送到上海生工测序，将测序结果与在NCBI上公布的序列进行比对。将测序比对结果为葡萄球菌的片段接种于各生化反应发酵管，培养24小时后观察结果。

2 细菌分离培养结果

两份乳样在麦康凯培养基上均可见有砖红色、圆形凸起的菌落，由此可见乳样中均含有大肠杆菌。含4%牛血清及0.1%裂解血的培养基及各种选择培养基上的菌落经16S PCR鉴定、序列比对及葡萄球菌生化反应试验，显示两份乳样中共分离出2种细菌，其中葡萄球菌属细菌共有5株，以金黄色葡萄球菌为最多。

3 小结与讨论

本次试验因病料采集数量有限，故分离出的细菌种类及数量均不是很多，同时当前仍有很多细菌不能通过细菌培养的方式获得。为全面获得致病菌信息，在牛乳房炎的诊治过程中，可考虑应用多重PCR及高通量测序进行鉴别。通常健康牛乳和患病牛分泌的乳汁中细菌种类很多，但最常见的乳房炎致病菌是大肠杆菌、乳房链球菌和克雷伯氏菌等，其次是停乳链球菌、化脓杆菌和金黄色葡萄球菌等。研究发现，在健康或亚临床乳样中乳房链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌等细菌含量应低于临床型乳房炎，且健康乳样中应不含有大肠杆菌。但本次试验在健康牛乳对照中也分离到了大肠杆菌，而乳房炎常见的病原菌如链球菌等均没有分离到，分析原因可能是由于单纯从临床症状来判定是否患有乳房炎而导致，缺乏SCC等方法对隐性乳房炎的排除。

在实际生产中应坚持以预防为主、早发现早治疗的原则来预防控制乳房炎。奶牛乳房炎按临床表现可分为急性型奶牛乳房炎、慢性型奶牛乳房炎和隐性奶牛乳房炎三种，及时治疗是遏制急性型乳房炎和慢性型乳房炎发展的关键措施，而对隐性乳房炎应重点加强控制和预防。调查发现，在各大养牛场中隐性乳腺炎普遍存在，其发病率可高达60%，对隐性病例如不及时诊治，则易转变成临床型乳腺炎，带来巨大的经济损失。奶牛乳房炎绝大多数都是因为乳区感染致病细菌而导致，因此对奶牛乳房炎的防控应从饲养环境、病原菌来源等基本环节入手进行人工干预。对于微生物感染引发的乳腺炎在诊治时应有针对性地选择药物和投药方法，有条件的养殖场最好首先进行药敏试验来筛选最佳药物进行有效治疗。奶牛发生乳腺炎会直接影响乳汁品质，人类饮用后也会影响健康，对公共卫生造成一定的威胁。应及时淘汰慢性或久治不愈的奶牛，防止病原微生物扩散，消除传染源。养牛场应定期进行全场牛的乳房炎检测及建立健全科学的疫病防御体系及检疫制度，以便及时了解该病的流行情况，降低乳房炎的发病率。